Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de amostras de glioma pontino intrínsecas difusas post-mortem para o estabelecimento de modelos de culturas de células derivadas de pacientes ou caracterização directa de células tumorais e microambiente.
Difusa Intrínseca Pontine glioma (DIPG) é um tumor do tronco cerebral na infância que carrega um prognóstico universalmente fatal. Porque a ressecção cirúrgica não é uma estratégia terapêutica viável e biópsia não é rotineiramente realizado, a disponibilidade de amostras de doentes para a pesquisa é limitado. Consequentemente, os esforços para estudar esta doença foram desafiados por uma escassez de modelos de doenças fiéis. Para endereçar esta necessidade, descrevemos aqui um protocolo para o rápido processamento de amostras de tecido da autópsia post mortem, a fim de gerar modelos de cultura de células derivadas de pacientes duráveis que podem ser utilizados em ensaios in vitro ou in vivo de xenoenxertos de experiências ortotópicos. Estes modelos podem ser utilizados para pesquisar potenciais alvos de drogas e estudar processos pathobiological fundamentais dentro DIPG. Este protocolo pode ainda ser estendido para isolar e analisar as células tumorais e usando microambiente celular activada por fluorescência (FACS), que permite a análise subsequente do gene expression, a expressão da proteína, ou modificações epigenéticas do DNA na célula granel ou nível de uma única célula. Finalmente, este protocolo pode também ser adaptado para gerar culturas derivadas de pacientes de outros tumores do sistema nervoso central.
DIPG é uma doença maligna nervoso central agressivo sistema que surge na ponte ventral, normalmente em meados de infância 1, 2. Apesar de décadas de ensaios clínicos, o tratamento corrente é limitada a radioterapia, o que proporciona uma melhoria temporária ou estabilização dos sintomas e só prolonga a sobrevivência mediana por uma média de 3 meses. Mesmo com a radioterapia, a sobrevida global mediana é de apenas 9 meses, com 90% das crianças que morrem da doença no prazo de 2 anos após o diagnóstico inicial. Devido à natureza infiltrante do tumor e as funções críticas do tronco cerebral, a ressecção cirúrgica não é possível. Além disso, nos Estados Unidos, a obtenção de biópsias cirúrgicas para DIPG não tem historicamente sido realizada 3, como análise histopatológica não tem nenhum papel corrente na orientação do tratamento clínico e diagnóstico pode tipicamente ser feita por neuroimagens sozinho. Assim, a disponibilidade de tecido de tumor fou o estudo é restrito, limitando os esforços para realizar pesquisas sobre as moléculas da droga candidatos e a biologia do tumor subjacente. Notavelmente, melhorias nas técnicas de neuroimagem e estereotaxia, têm permitido o desenvolvimento de biópsias seguros de DIPG nos últimos anos 4, que, quando combinado com avanços na biologia molecular, têm transformado nossa compreensão da doença. Atualmente, vários estudos clínicos com biópsia inicial e perfil molecular de DIPG para a individualização de planos de tratamento estão em curso (NCT01182350, NCT02274987) 5.
DIPG e outros gliomas de alto grau pediátricos representam doenças distintas de seus colegas de adultos com glioblastoma 6, 7 e modelos experimentais, assim, fiéis de DIPG são necessários para entender sua fisiopatologia única e descobrir estratégias terapêuticas eficazes. Nos últimos anos, concentrou esforços para obter tumor DIPG tproblema para a investigação no momento da autópsia ou, menos comumente, a biópsia revolucionaram a nossa compreensão e capacidade de estudar DIPG. Esforços de sequenciamento de todo o genoma revelou uma mutação recorrente na histona H3, 3A família (H3F3A) e cluster de histonas 1, H3b (HIST1H3B), o que representa o primeiro exemplo de doença humana causada por mutações no histona de codificação de proteínas 8, 9, 10, 11 . Além disso, um subconjunto de DIPGs expressa mutações no gene ACVR1, que não tenham sido previamente reportados em câncer, mas são idênticas às mutações encontradas no congênita infância developmental disorder fibrodisplasia ossificante progressiva 8, 9, 10, 11. Assim, as primeiras culturas de células DIPG derivadas de pacientes e mo xenotransplante ortotópicodels agora foram estabelecidos 1, 2, 12, 13, 14, bem como modelos de ratinho estabelecidas através do xenotransplante directa de células tumorais em ratinhos imunodeficientes para gerar os xenoenxertos de série 3, 14, 15. Esforços de pesquisa de fármacos iniciais utilizando esses modelos derivados do paciente identificaram novos agentes promissores para a tradução clínica 4, 14 e lançaram as bases para pelo menos um ensaio clínico (NCT02717455).
Estes primeiros passos no sentido do progresso são apenas o começo, e numerosas amostras de tecido derivadas de pacientes e modelos de cultura será necessário definir os subtipos da doença e desenvolver as estratégias terapêuticas mais eficazes. geneticamente motormodelos de rato recer de DIPG também facilitará estudos destinados a aprofundar a nossa compreensão básica da doença. Os esforços feitos para gerar modelos genéticos para DIPG será auxiliado pelos estudos genômicos fundamentais discutidos acima, mas, actualmente, um número limitado de opções estão disponíveis. Um tal modelo, o que gera os gliomas do tronco cerebral de alto grau histologicamente semelhantes, utiliza o viral RCAS / televisão de um sistema para dirigir a sobre-expressão de PDGF-B e perda INK4A-IRA em células nestina-positivas na fossa posterior de ratinhos neonatais 5, 16. Outra abordagem envolve recapitulando vários grandes mutações associadas à DIPG (mutação K27M histona H3.3, perda de p53 e ativação PDGFRA) em células precursoras neurais derivadas de células-tronco embrionárias humanas, o que é suficiente para tornar essas células tumorigénicas 6, 7, 17. A combinação de métodos genéticos e paciente-derivmodelos ed permitirá testes pré-clínicos e promover o desenvolvimento de terapias eficazes.
Para enfrentar os desafios à investigação DIPG detalhado acima, este protocolo de autópsia rápida foi desenvolvido para gerar culturas de células derivadas de pacientes para investigação 8, 9, 10, 11, 12, 14. O protocolo destina-se a proteger a viabilidade do tecido e maximizar a probabilidade de gerar culturas duráveis, apesar dos desafios associados com intervalos post mortem estendidos e tempo de transporte. Quando gerado com êxito, estas culturas DIPG pode ser usado em subsequentes manipulações in vitro e em experiências de xenoenxerto in vivo, permitindo a avaliação de potenciais moléculas terapêuticas sobre as células derivadas do paciente.
Este protocolo descreve um método para o rápido processamento de post-mortem doações de tecido de tumor para o desenvolvimento de culturas de células derivadas do paciente, que pode ser usada em uma variedade de ensaios in vitro ou in vivo. Devido à natureza de trabalhar com amostras de autópsia, mantendo a viabilidade da amostra representa um desafio significativo. Vários factores contribuem, incluindo o intervalo post mortem a autópsia ou o tempo necessário para o transporte do tecido, deve ser minimizado tanto quanto possível, mas muitas vezes são difíceis de controlar. Em nossa experiência, um intervalo pós-morte de menos de 6 – 8 h (desde o momento da morte até a hora que o tecido é colocado em transporte gelada e meios de transporte) rendeu a melhor chance de criar uma cultura de células durável. É melhor, então, receber o tecido no laboratório dentro de 24 h, e processá-lo para a cultura imediatamente após o recebimento.
Uma vez que a localização desses casos raros varia amplamente, ea qualidade da etapa de recuperação do tecido afecta fortemente a chance de sucesso, a logística de realizar a autópsia pode ser um desafio. Em muitos casos, a fim de atingir o período de tempo de 6-8 horas, não é viável para realizar a colheita de tecido num centro académico. Em vez disso, ter um serviço de recuperação de tecidos na chamada para recuperar o tecido do tumor na casa funerária no âmbito de um protocolo IRB-aprovado é muitas vezes mais conveniente para a recuperação de tecidos. Obtenção do consentimento informado antes da morte é recomendada e facilita o planejamento logístico. Preparar kits de autópsia independentes com instruções claras e completas e suprimentos estéreis para a recuperação do tecido (luvas, cortinas, bisturis) é fortemente recomendado. Além disso, o estabelecimento de pontos claras de comunicação entre o investigador, patologista, e funerária é crítica. Por exemplo, o investigador deve discutir o protocolo com o patologista antes da autópsia e destacar erros comuns. Esses erros incluem microcontaminação Bial (geralmente levedura) durante a recuperação de tecidos, insuficiência de escoar pela expedição e falha para enviar a amostra em gelo húmido suficiente em um recipiente thermoinsulated durante a noite / acelerada. Finalmente, recomendamos o uso de um serviço de correio porta-a-porta para a expedição da amostra para minimizar o tempo de transporte.
Cuidados também devem ser tomados durante a dissociação de tecidos para preservar a viabilidade celular. Por exemplo, o uso dos meios de comunicação concebido para preservar a saúde do tecido neural para o transporte (Hibernate-A suplementado com antibiótico / antimicótico) irá aumentar a chance de gerar uma cultura de sucesso. É também importante para manter a amostra a uma temperatura fria durante todo o protocolo de transferência sempre as amostras em gelo. Coleta de ambas as frações de dissociação mecânicos e enzimáticos, juntamente com minimizando trituração pode melhorar o sucesso do protocolo, como ambos os passos são traumáticas para as células. Em nossa experiência, enquanto a maioria das culturas bem sucedidas crescer fora de ambas as fracções, Tivemos casos em que apenas uma das duas preparações estabelecidas uma cultura durável, potencialmente, reflectindo a natureza delicada destas amostras. Outro passo traumática no protocolo é a trituração; uma estratégia que pode reduzir o grau de trituração é necessário para assegurar que as amostras são cuidadosamente triturada no início da preparação. Outros exemplos de aspectos do protocolo concebido para melhorar a viabilidade da amostra incluem tampões (por exemplo, adicionando, HEPES) ao longo do protocolo, o que é especialmente crítico durante a dissociação enzimática.
Uma possível modificação do presente protocolo para aumentar ainda mais a viabilidade das células é a remoção da etapa de lise de glóbulos vermelhos ACK. No entanto, neste caso, muitas vezes é então necessário efectuar uma etapa de lise ACK durante a primeira semana de cultura para eliminar as células vermelhas do sangue. Outro aspecto deste protocolo que pode ser modificado é a eliminação de mielina e detritos celulares usando uma densit sacarosegradiente y. Especificamente, outras estratégias que foram relatadas para melhorar a viabilidade celular de células microgliais também são possíveis nesta fase, tal como um gradiente descontínuo de Percoll 18 ou pérolas magnéticas de remoção da mielina.
Finalmente, a duração de dissociação entre o tecido inicial e o aparecimento de neuroesferas varia entre amostras e pode levar de uma semana a um mês ou mais. Uma vez que as culturas iniciais contêm tipicamente um grau significativo de células mortas e detritos celulares, pode ser um desafio para determinar se as células viáveis permanecem; a cultura deve ser mantida durante pelo menos 4 – 8 semanas (Figura 2). Uma estratégia para isolar as células que crescem a partir do resíduo restante é aqui apresentado (ie reverter filtragem grupos de células e re-plaqueamento em meio fresco). A decisão sobre se deve continuar a manter uma cultura é em última instância uma decisão caso a caso com base em fatores que cercam the autópsia (por exemplo, um prolongamento do intervalo post-mortem, os problemas durante o transporte do tecido), a dissociação de tecidos (por exemplo, sangue ou detritos excessivos), e como o exemplo aparece na cultura. Uma vez que uma cultura é estabelecida, a identidade deve ser validado por fingerprinting de DNA por meio de análise de repetições em cadeia curta ou um método semelhante, comparando a cultura de uma amostra do tumor original retido para esta finalidade. Recomendamos rotineiramente validar culturas por impressões digitais de DNA para assegurar que nenhuma contaminação por outras culturas ocorreu, por exemplo, a cada 3 – 6 meses.
A geração dessas culturas DIPG derivados de paciente representa um passo importante no desenvolvimento bem sucedido de terapias eficazes. A expansão dos modelos de culturas DIPG derivado do paciente e de xenotransplante disponíveis será fundamental para identificar as estratégias terapêuticas mais eficazes e, finalmente, superar esta doença devastadora.
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem o apoio da Claire Foundation McKenna, Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame (NINDS K08NS070926 e R01NS092597), Departamento de Defesa (NF140075), California Institute for Regenerative Medicine (CIRM RB4-06093 e RN3-06510), Alex Lemonade Fique Foundation, The Cure Starts Now Foundation e DIPG Collaborative, Lyla Nsouli Foundation, Unravel Oncologia Pediátrica, Tumor Fundação Infância Cérebro, Matthew Larson Foundation, Fundação V, Fundo da família de Godfrey em memória de Fiona Penelope, o DIPG Fundação Wayland Villars, o Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, e Jennifer Fundos Memorial Kranz, Fundação N8, Virginia e do Fundo Ludwig DK for Cancer Research, criança Health Research Institute da Universidade de Stanford Anne T. e Robert M. Bass Endowed Faculdade de bolsas em Pediatric cancerosas e de sangue doenças.
Hibernate-A | Gibco | A12475-01 | |
HBSS with Calcium/Magnesium | Gibco | 24020-117 | |
HBSS | Corning | 21-022-CV | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
Liberase DH (Collagenase/Dispase) | Roche | 5401054001 | |
DNAse I | Worthington Biochemical | LS002007 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
Antibiotic/Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
Neurobasal-A | Gibco | 10888-022 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330-032 | |
GlutaMAX-I (100X) | Gibco | 35050-061 | |
Sodium Pyruvate (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
B27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 12587-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids (100X) | Gibco | 11140-050 | |
Human PDGF-AA | Shenandoah Biotechnology | 100-16 | |
Human PDGF-BB | Shenandoah Biotechnology | 100-18 | |
Human EGF | Shenandoah Biotechnology | 100-26 | |
Human FGF | Shenandoah Biotechnology | 100-146 | |
Sterile scalpel blades | Bard Paker | 372610 | |
Curved hemostats | Fine Science Tools | 13013-14 | |
Razor blades | VWR | 55411-050 | |
100 x 20 mm cell culture dish | Corning | 353003 | |
Sterile forceps | TWD Tradewinds | DF8988-5 | |
Sterile drapes | 3M | 2037 | |
Sterile gloves | Kimberly Clark | 1182307 | |
ACK Lysis Buffer | Gibco | A1049201 | |
100 micron mesh filter | Fisher | 352360 | |
50 mL conical tube | Fisher | 1495949A |