Summary

Organotypic fatias Hippocampal culturas como um modelo para estudo neuroproteção e invasão de células tumorais

Published: August 27, 2017
doi:

Summary

Culturas de fatias hippocampal organotypic (OHSC) representam um modelo in vitro que simula a situação na vivo muito bem. Aqui descrevemos uma vibratome de base melhorada fatiar protocolo para obter fatias de alta qualidade para uso em avaliar o potencial neuroprotetor do romance substâncias ou o comportamento biológico das células tumorais.

Abstract

Em culturas hippocampal fatia de organotypic (OHSC), as características morfológicas e funcionais dos neurônios e células gliais estão bem conservadas. Este modelo é apropriado para abordar questões de pesquisa diferentes que envolvem estudos na neuroproteção, eletrofisiológicos experiências em neurônios, redes neuronais ou invasão do tumor. A arquitetura hippocampal e atividade neuronal em circuitos multisynaptic estão bem conservados em OHSC, mesmo que o próprio procedimento corte inicialmente lesões e leva à formação de uma cicatriz glial. A formação de cicatriz presumivelmente altera as propriedades mecânicas e comportamento difusiva de pequenas moléculas, etc. Fatias de permitam o monitoramento de processos dependentes de tempo após a lesão cerebral sem cirurgia animal e estudos sobre interações entre vários tipos de células derivado do cérebro, ou seja, astrócitos, micróglia e neurônios sob fisiológicos e patológicos condições. Um aspecto ambivalente deste modelo é a ausência de fluxo sanguíneo e as células imunes do sangue. Durante a progressão da lesão neuronal, migração de células do sistema imunológico da peça sangue um papel importante. Como essas células estão falta em fatias, os processos intrínsecos da cultura podem ser observados sem interferência externa. Além disso, em OHSC a composição do ambiente externo médio é precisamente controlada. Uma vantagem adicional desse método é o menor número de animais sacrificados, em comparação com preparações padrão. Vários OHSC pode ser obtido de um animal, possibilitando estudos simultâneos com vários tratamentos em um animal. Por estas razões, OHSC são adequados para analisar os efeitos das novas terapias protetora após dano tecidual ou durante a invasão do tumor.

O protocolo apresentado aqui descreve um método de preparação de OHSC que permite gerar altamente reprodutível, bem preservado fatias que podem ser usadas para uma variedade de pesquisa experimental, como estudos de invasão de neuroproteção ou tumor.

Introduction

OHSC é um modelo bem caracterizadas em vitro para estudar propriedades fisiológicas e patológicas dos neurônios, astrócitos e microglia1. É fácil de controlar o ambiente extracelular e monitorar as mudanças morfológicas e celulares após vários estímulos. A organização dos neurônios hippocampal e suas conexões estão bem conservadas após preparação2,3. Fora várias vantagens, OHSC permitem o monitoramento da invasão de lesão e tumor cerebral sem cirurgia animal. Seis a oito OHSC pode ser obtido de um único cérebro de roedor. OHSC, portanto, ajudar a significativamente reduzir o número de animais e permitir testes várias concentrações de droga, manipulações genéticas ou modelos de lesão diferentes no mesmo animal. Fatia com base em ensaios, em condições experimentais podem ser precisamente controladas. Além disso, desenvolvimento dependente do tempo de condições patológicas como danos secundários facilmente pode ser monitorado pela imagem latente de lapso de tempo.

No protocolo determinado, originalmente estabelecido por Stoppini et al 4, as etapas de preparação são descritas e destacam-se importantes marcos morfológicos para a seleção de fatias apropriadas. Recomendamos a preparação de pós-Natal dia 7-9 ratos ou camundongos pós-Natal dia 4-5. Nesses períodos, OHSC mostram uma resistência robusta de traumas mecânicos e um elevado potencial para a reorganização dos circuitos neuronais. Em contraste, preparações de ratos embrionários ou adultos rapidamente mudam sua estrutura e perdem sua morfologia de organotypic durante o cultivo e, portanto, são menos adequadas para o estudo de processos a longo prazo em investigação básica5,6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11. outro ponto crítico para a taxa de sobrevivência de OHSC é a espessura da fatia em si, como a difusão e, portanto, o fornecimento de nutrientes são limitadas12,13,14.

Protocol

experiências em animais foram realizadas em conformidade com a política da ética e da política sobre a utilização de animais na investigação neurociência como aprovado pela Europeu comunidades Conselho Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho da União Europeia relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos. 1. preparação dos instrumentos e meios de cultura para a preparação de OHSC usar o seguinte conjunto de instrumentos: duas t…

Representative Results

Estudos de neuroproteção: Para determinar o dano neuronal, o número de núcleos positivos de PI e IB4 positivo microglia em cada terceira secção óptica da camada de células grânulo (GCL) de giro do pectínea (DG) foi contado. Para experiências de invasão do tumor, o z-projeção de intensidade máxima da pilha foi usado para calcular a área coberta por células tumorais, como uma medida de invasão e Visualizar padrões diferentes de invasão (<stron…

Discussion

O presente protocolo descreve a preparação de OHSC. Esse modelo permite que o teste de recursos intrínsecos e reações do tecido cerebral após a aplicação de estímulos fisiológicos e patológicos. Além de análises de parâmetros eletrofisiológicos, OHSC pode ser lesado e os efeitos de dano em todos os tipos de células podem ser determinados. Tratamento com substâncias diferentes e a descrição detalhada dos processos de maciços ou na ausência de macrófagos e linfócitos de cura é possível.

<p clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer a Christine Auste o seu apoio com a gravação de vídeo e Chalid Ghadban por sua excelente assistência técnica. Urszula Grabiec foi apoiada pelo Roux Programm FKZ 29/18.

Materials

6-Well Falcon 35-3046
Agar Fluka 5040
Autoclav Systec DX-45
CFDA  Thermo Fisher V12883
Confocal laser scanning microscope (CLSM) LSM700 Carl Zeiss
Eagle´s Minimal Essential Medium  Invitrogen 32360-034
Fluorescein labeled Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I Vector Labs FL-1101
Fluorescein labeled GSL I – isolectin B4 Vector Labs FL-1201  
Glucose Merk 1083371000
Glutamin Invitrogen 25030-024
Hank´s Balanced Salt Solution (with Ca2+ and Mg2+) Invitrogen 24020-133
Hank´s Balanced Salt Solution (without Ca2+  and Mg2+) Invitrogen 14170-138
Insulin Sigma Aldrich I5500
L-ascorbic acid Sigma Aldrich A5960
L-Glutamin Invitrogen 25030-024
LN229 Cell-Lines-Service 300363
Medical cyanoacrylate glue (Histoacryl glue) B.Braun 1050052
Millicell Culture Inserts Millipore PICMORG50
NMDA N-methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich M3262
Normal Horse Seum Invitrogen 26050-088
Penicillin Streptomycin Invitrogen 15140-122
Petri dishes (all sizes) Greiner 627160/664160/628160
PFA Roth 0335.1 toxic
Propidium iodid (PI) Sigma Aldrich 81845-25MG toxic
U138 ATCC HTB-14
Vibratome Leica Leica VT 1200

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Cite This Article
Grabiec, U., Hohmann, T., Hammer, N., Dehghani, F. Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (126), e55359, doi:10.3791/55359 (2017).

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