Summary

マウスからの初代肝細胞培養における炎症反応の誘導

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

ここでは、成体マウスからの初代肝細胞を単離するための酵素的アプローチを示し、我々は、ELISAおよびリアルタイムPCRを使用して炎症反応の定量化を記載します。

Abstract

肝臓は、全身性炎症の調節において決定的な役割を果たしています。特に慢性腎臓病では、肝臓は尿毒症環境、酸化ストレス、内毒素血症および急性期反応物質を大量に製造することにより炎症性サイトカインを循環させる減少クリアランスに応じて反応します。炎症や肝細胞の根本的な役割を研究するための実験的なツールは、特に、慢性腎臓病などの複雑な設定で、全身の急性期応答および長期の炎症誘発性シナリオに肝臓のサイトカインの調節および貢献を理解することが重要です。 生体内で炎症の複雑なメカニズムを研究することは困難なままであるため、通常はリソースを大量に消費するとは、トランスジェニック動物の使用を必要とし、第一の単離肝細胞は、肝臓の急性期反応に機構的洞察を得るための強力なツールを提供しています。このインビトロ技術は、中程度のコストを提供していますので、高い再生産性および技術常識には、一次単離された肝細胞はまた、容易にスクリーニング手法として使用することができます。ここでは、初代マウス肝細胞を単離するために、酵素ベースの方法を記載し、そして我々は、ELISAおよび定量的リアルタイムPCRを用いて、これらの細胞における炎症反応の評価を記述する。

Introduction

慢性腎臓病(CKD)は、急性および慢性炎症1の状態として定義することができます。 CKDを有する患者において、phosphaturicホルモン線維芽細胞増殖因子23(FGF23)の血清レベルは、徐々に、血清リン酸塩のホメオスタシス2を維持するために上昇します。増加した血清FGF23レベルは独立して、血液透析治療3、4始めている患者の間で心血管疾患の罹患率と死亡率に関連付けられています。さらに、いくつかの臨床研究が上昇FGF23レベルおよびC反応性タンパク質(CRP)、インターロイキン6(IL-6)および腫瘍壊死因子α(TNFα)5、6の血清レベルの間に強い相関関係を示しています。また、実験的研究では、我々は、FGF23直接肝細胞を標的とし、CRPおよびIL-6 Pを増加させることにより炎症反応を引き起こすことができることが最近実証されています肝臓7でroduction。したがって、FGF23は、CKDにおける全身性炎症に貢献する循環因子として作用することがあります。

70年代初めには、初代肝細胞を単離し、初めて8のために勉強しました。それ以来、初代培養肝細胞が広範囲に代謝処理、ホルモン機能、薬物代謝および毒性を調べるだけでなく、免疫および炎症反応9、10に使用されてきました。以前のプロトコルは、主に、ヒト肝組織11、12からの一次肝細胞の酵素の単離を記載しています。優れたモデルが、これは複雑な肝臓のシグナル伝達機構と同様に刺激の異なる種類に応じて機能的結果にどのように影響するかを遺伝子操作研究する能力を残します。以下では、我々は、マウス初代肝細胞の単離を記載しています。注目すべきことに、このようなリポ多糖(LPS)、IL-6及びFGF23などの肝臓の急性期反応のいくつかのメディエーターの効果は、簡単、迅速かつ再現可能な方法13で解析することができます。

ここで、我々は、成体マウスからの肝細胞の酵素を単離するためのプロトコルを提示し、我々はそのようなLPSおよびIL-6などの炎症の確立された誘導物質、ならびにFGF23としての新規炎症性メディエーターは、直接の発現および分泌を刺激することができることを実証していますこのような培養肝細胞におけるCRPおよびIL-6などの炎症性サイトカイン、。

Protocol

全ての動物プロトコルおよび実験手順は、医学のマイアミミラー科大学の施設内動物管理使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1.準備予熱肝臓灌流媒体および肝臓を37℃の水浴中で媒体を消化します。 灌流ポンプ(30ミリリットル/分)を設定します。慎重に肝灌流メディアとポンプの配管システムを事前入力。システム内の任意の気泡を避け、定?…

Representative Results

組織学一次単離および培養された細胞の代表的な光学顕微鏡像を、 図1Aに示されています。免疫細胞化学分析は、単離された肝細胞は非常アルブミン(赤)、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体4(FGFR4)(緑色)を発現することを示しています。核は4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)(青)で染…

Discussion

マウスからの初代肝細胞を分離することにより、ex vivoでの炎症反応を研究するために、高速、安価で信頼性の高いツールです正しく実行した場合、結果は容易に生成され、タイムリーかつ費用効率的な方法で再生することができます。以下の点を慎重に成功した絶縁を確保するために評価されるべきです。

外科的切開とIVCのカニュレーションは、全身麻?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIH(R01HL128714 CF)と(KSへF31DK10236101)とアメリカ心臓協会(CFとAG)によってサポートされていました。

Materials

Consumables
Cell Strainer 70 μm Nylon cell strainer Falcon 352350
BD Insyte Autoguard BD 381412
50 mL Polypropylene Conical Tube Falcon 352098
100 6-inch Cotton Tipped Applicators  Puritan 806-WC
1cc U-100 Insulin Syringe 28 G 1/2 Becton Dickinson 329420
Tissue Culture Dish 100 x 20 mm Style Corning 353003
6 well Cell Culture Cluster Costar 3516
5/0 Black Braided Surgical Silk (100 yards) LOOK SP115
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Minipuls 3 Perfusion Pump Gilson F155007
Hemacytometer Kits, Propper VWR 48300-474
Hemacytometer Cover Glasses, Propper VWR 48300-470
Surgical Scissers – Sharp/Blunt F.S.T. 14001-12
Iris Scissors-ToughCut Straight F.S.T. 14058-11
Dumont SS-45 Forceps F.S.T. 11203-25
Student Tissue Forceps F.S.T. 991121-12
Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Acetic acid solution, 2.0 N Sigma     A8976-100ML
Isoflurane, USP 250 mL Piramal Healthcare    66794-013-25
KetaVed 1000mg/10mL (100mg/mL) VEDCO     50989-161-06
Xylazine 100 mg/mL AnaSed Injection 139-236
Willams' Medium E (1x) gibco 12551-032
Liver Perfusion Medium (1x) gibco 17701-038
Liver Digest Medium (1x) Life Technologies 17703034
Primary Hepatocyte Thawing and Plating Supplements Life Technologies CM3000
Primary Hepatocyte Maintenance Supplements Life Technologies CM4000
Phosphate Buffer Saline (PBS) pH 7.4 ThermoFisher scientific 10010031
Collagen Type 1 Corning 354236
Trypan Blue Solution VWR 45000-717

References

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Cite This Article
Czaya, B., Singh, S., Yanucil, C., Schramm, K., Faul, C., Grabner, A. Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice. J. Vis. Exp. (121), e55319, doi:10.3791/55319 (2017).

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