В этой статье описан способ измерения аллореактивности в смешанной популяции Т-клеток с использованием проточной цитометрии изображений.
Измерение иммунологической реактивности к антигенам доноров, у реципиентов трансплантата, вероятно, будет решающим для успешного снижения или отмены иммуносупрессии. Неоднозначную реакцию лейкоцитов (MLR), предельное разведение пробы, и транс-виво гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) анализа все были применены к этому вопросу, но эти методы имеют ограниченную предсказательную способность и / или существенные практические ограничения , которые уменьшают их полезность. Изображений проточной цитометрии является метод, который сочетает в себе многопараметрических количественные полномочия проточной цитометрии с возможностями обработки изображений флуоресцентной микроскопии. Недавно мы использовали в проточной цитометрии подхода визуализации для определения доли реципиентов Т-клеток, способных к образованию зрелых иммунным синапсов с донорскими антигенпрезентирующими клетками (АРС). Использование хорошо охарактеризованных мыши модели по пересадке сердца, мы показали , что частота в пробирке иммунных синапсов между Т-APC MembrАНЭ контактные события сильно предсказал исход аллотрансплантата в отторжении, толерантности, и ситуации, где выживание трансплантата зависит от индуцированных регуляторных Т-клеток. Частота Т-APC контактов увеличивается с Т-клетками от мышей во время острого отторжения и уменьшается с Т-клетками от мышей, оказываемой невосприимчивы к Аллоантигену. Добавление регуляторных Т – клеток к системе в пробирке уменьшается длительные контакты Т-APC. Чрезвычайно важно, этот эффект также был отмечен с человеческим поликлонально расширенной, встречающихся в природе регуляторных Т-клеток, которые, как известно, контролируют отторжение тканей человека в гуманизированных мышиных моделях. Дальнейшее развитие этого подхода может позволить более глубокой характеристику аллореактивного Т-клетки в отсеке реципиентов. В будущем, дальнейшее развитие и оценка этого метода с использованием человеческих клеток может служить основой для анализов, используемых для отбора пациентов для минимизации иммуносупрессии, и он может быть использован для измерения воздействия tolerogenIC терапии в клинике.
Твердые трансплантации органов превратило уход за пациентами с терминальной стадии заболеваний почек, печени, сердца и легких. Из-за различий в основных и второстепенных антигенов гистосовместимости, однако, Аллотрансплантаты незамедлительно отвергнуто реципиентов Т-клетками, если иммунодепрессанты не используются. Эти агенты имеют многочисленные неблагоприятные последствия, в том числе риски для рака и органной дисфункции. Поэтому основная клиническая цель состоит в том, чтобы снизить дозу иммуносупрессии до минимального уровня, необходимого для предотвращения отторжения трансплантата. Этот уровень может меняться в зависимости от степени активации врожденной иммунной системы; степень донор-реципиент несоответствия аллоантигена; и различия между пациентом в иммунной функции, фармакокинетики, фармакодинамики и.
К сожалению, врачи пересадки не имеют каких – либо инструментов для точной оценки донорской реактивности у отдельных пациентов 1. смешанныйРеакция лейкоцитов (MLR) может обнаружить донор реактивность, но он не может надежно предсказать исход трансплантата 2, 3. Лимитирующее разведение, анализы цитокин ELISPOTs, и транс-виво анализ либо измерить ограниченный диапазон ответов или не практичны 4, 5, 6, 7, 8 профилей экспрессии .Gene выявили сигнатур , связанные с оперативной толерантностью 9, 10, 11, 12 и отторжение 13, 14, 15, но это не всегда обобщенные по населению 16 и в конечном счете , может иметь ограниченную полезность в отдельных пациентах. Последовательность на основе AnalyГОС Т-клеточного рецептора (TCR) Т – клеток в периферической крови 17 или пролиферирующих в MLR 18 также были разработаны , но требуют дальнейшей проверки.
Концептуально, было бы желательно иметь анализ, который обнаруживает самые ранние шаги необходимые в активации Т-клеток реципиента с помощью антигена донора. Поскольку культивирования клеток в течение нескольких дней (как в MLR) можно ввести артефакты, такой тест, в идеале, не требуют измерений последующих событий, например, пролиферации или эффекторной функции. В равной степени, однако, было бы также желательно, чтобы тест, чтобы зависеть от некоторого элемента функции Т-клеток, так как чисто описательных оценок (Например, TCR – секвенирование) может быть не в состоянии различать анергические и функциональные Т – клетки.
Многочисленные исследования показали, что длительный Т-АРС контакт необходим для формирования иммунного синапса, который является важным первымшаг в ответ Т-клеток 19, 20, 21, 22. Мы недавно сообщили , что во время динамического в пробирке время покадровой обработки изображений, около 5 – 10% от мыши CD4 + Т – клетки образуют длительные контакты с аллогенной полученных из костного мозга дендритных клеток (BMDCs) 23. Частота длительного контакта была увеличена у животных, отклоненных трансплантата, тогда как у мышей , ранее оказываемых толерантными к тем же антигены, она оставалась на уровне видели в untransplanted мышей 23. Продолжительные взаимодействия были уменьшены в присутствии получателя Tregs и увеличение в их отсутствие, и мы наблюдали подобные явления с помощью Т – клеток человека и аллогенных моноцитов ДК (MoDCs) 23.
Тем не менее, перечисление длительных контактов сделано в поликлональном Т-клеток populatioп отнимает много времени и трудоемким. Поэтому мы сделали использование изображений проточной цитометрии для изучения формирования аллогенного иммунного синапса. Изображений проточной цитометрии включает в себя многопараметрических сбора и анализа данных, возможности обычного проточной цитометрии с возможностями визуализации одноклеточного флуоресцентной микроскопии. Эта техника была использована другими исследователями для изучения формирования иммунного синапса с помощью моноклональных Т – клеток 24, 26, 27 или в присутствии суперантигенов 28. В таких условиях, однако, частота реагирующих Т – клеток в диапазоне от 30-100%, в то время как аллореактивные Т – клетки , как правило , по оценкам, представляют 5-15% от общего репертуара Т-клеток 29, 30, 31, 32. Важно отметить, что мы показали, что поток изображений цитометрии может производить аиERy сопоставимой мера аллореактивных частот Т-клетки 23 и что изменения в частоте синапса внутри популяции Т-клеток поликлональной позволяют прогнозировать исход трансплантата 23. В настоящее время этот подход был оптимизирован для измерения прямой аллореактивности CD4 + Т – клеток, но, в принципе, также могут быть разработаны для изучения CD8 + Т – клеток , и косвенный путь. Косвенное аллореактивность , как полагают, становится все более актуальным при более длительном времени после трансплантации 33. Мы в настоящее время разрабатываем этот метод, чтобы использовать клетки человека, что позволит для тестирования больных. Таким образом, в будущем, общий подход может быть полезен для функциональной оценки Т-клеточных реакций в реципиентов трансплантата перед трансплантацией; сразу же после трансплантации; и в долгосрочной перспективе, когда минимизация наркотиков становится важной задачей.
Изображений проточной цитометрии был использован , чтобы продемонстрировать формирование иммунного синапса между моноклональными Т – клеток и АРС или в присутствии суперантигенов 24, 25, 26, 27, 28. Этот метод использует тот факт , что после продуктивного Т-клеток APC контакта, Т – клетка перестраивает свой актиновый цитоскелет, поляризационный его к месту контакта 21. Эта перестановка не происходит без сигнализации TCR, и поэтому она является ранним коррелятом активации Т-клеток 19, 20, 21. Метод, представленный здесь адаптируется этот подход к измерению аллореактивных частот Т-клетки в популяции Т-клетки поликлональной. Как таковой, он может в будущем служить в качестве основы для разработки тестов для доноров reactivi ти в клинической трансплантации.
Хотя прямые сравнения еще не было сделано, обнаружение аллореактивными иммунных синапсов, как представляется, имеют высокую предсказательную силу, чем обычные СКЛ. Например, предыдущая работа показала , что в протокол было описано выше , способствующие развитию толерантности, результаты в MLR не достоверно коррелирует с исходом трансплантата 2.
Целый ряд анализов были разработаны для операционно толерантного состояния у человека 9, 10, 11, хотя они не измеряют эффекторной функции клеток в ответ на аллоантиген. В противоположность этому , IFN- , ELISPOT анализах функции 8 мера эффекторных Т-клеток , но не может охватить весь спектр секреции цитокинов , которые могут иметь отношение к острым и хроническим отторжение аллотрансплантата, такие как IL-17 38,> 39. Предельного разбавления для анализа 4, который является трудоемким, а анализ транс-виво 6, который требует мышей, имеют существенные практические ограничения , которые препятствуют их применение в клинической практике . Недавние усовершенствования по анализу пролиферирующих клеток с использованием анализа последовательности TCR Т – клетки , реагирующих в СКЛЕ могут иметь значение, но , как анализ , представленный здесь, требуют дальнейшей проверки в клинических исследованиях 18, 40.
Дальнейшее развитие анализа на обнаружение иммунного синапса потребует ряд важных вопросов без ответа. Во-первых, анализ, разработанные только меры прямого аллореактивности. Прямой путь включает презентацию аллогенных MHC / пептидные комплексы на донорном полученное АРС. Последнее, как правило, устраняются быстро после трансплантации, и далее аллоантиген презентация Карриред путем АРС-получателей, представляющее нетронутые доноры MHC (пол-прямого путем) или обработанных антигенами-доноров на себя MHC (непрямой путь). Непрямой путь является важным фактором хронического отторжения аллотрансплантата 33, 41.
В принципе, это должно быть возможно обнаружить косвенные иммунные синапсы с помощью этого анализа, но косвенно аллореактивный Т – клетка имеет значительно более низкую частоту , чем прямые из них 42, 43, а это означает , что потребуется анализ большего числа событий. Второе соображение состоит в том , что мы проверили только с помощью этого анализа CD4 + Т – клеток, тогда как CD8 + Т – клетки также являются важным компонентом ответа анти-донора. Опять же , это должно быть возможно обнаружить CD8 + Т – клеток-APC синапсы с использованием этого метода. Другим ограничением является то, что этот метод требует ручной обзор и анализ изображений клеток в конечном MembRane контакт ворота, и мы сейчас работаем над автоматизацией этого шага.
Наконец, метод требует тестирования и развития в людях, и предварительные исследования с человеческими образцами в настоящее время выполняются. Далее фенотипический анализ Т-клетки подмножества (т.е. эффектор, память, нормативный и т.д.) в сочетании с обнаружением иммунных синапсов в реципиентах будет представлять собой мощный подход для характеристики аллореактивного Т-клеточного репертуара и будет важным направлением для будущая работа.
The authors have nothing to disclose.
SCJ была поддержана Международным обществом сердца и легких Трансплантация Research Fellowship и Королевского колледжа врачей и хирургов Канады Detweiler путешествую Fellowship.SM была частично поддержана Международным обществом сердца и легких Трансплантация премии развития карьеры (к) ВСП. СС при поддержке Национального института исследований в области здравоохранения Oxford Biomedical Research Centre.JH является получателем почки Research UK Старший Неклинические Fellowship. Эта работа финансировалась следующими гранты AB и KW: в Wellcome Trust грантовой программе (082519Z07Z), в British Heart Foundation Program Grant (PG / 10 / 62,28504) и Рамочной программы ЕС 7 (в одном исследовании; BioDRIM). Авторы хотели бы поблагодарить Майкл Парсонса и проточная цитометрия основного комплекса в научно-исследовательском институте Lunenfeld-Таненбаум, систему здравоохранения Синая, Торонто для обеспечения доступа и поддержки с инструментом ImageStream Mark X.
Phosphate-buffered saline | Various | Varies | |
Ethylenediamenetetraacetic acid, 0.5M solution | Thermo Fisher Scientific | AM9260G | |
Triton X-100 nonionic detergent | Sigma-Aldrich | X100 | |
Beta-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1635 | Solution is 37% formaldehyde and so must be diluted 25 times for 1.5% solution |
Cell strainers, 70 μm pore size | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
Phalloidin-fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P5282 | |
7-aminoactinomycin D | Thermo Fisher Scientific | A1310 | Reconstitute in DMSO |
Allophycocyanin-conjugated anti-mouse CD90.2 | eBioscience | 17-0902 | |
Pacific blue-conjugated anti-mouse CD11b | eBioscience | 48-0112 | Pacific blue has been replaced by eFluor 450 |
Biotinylated anti-mouse CD3 | eBioscience | 13-0032 | |
Biotinylated anti-mouse MHC class II | eBioscience | 13-5321 | |
Biotinylated anti-mouse B220 | eBioscience | 13-0452 | |
Biotinylated anti-mouse CD8 | eBioscience | 13-0081 | |
Biotinylated anti-mouse CD19 | eBioscience | 13-0193 | |
Anti-biotin microbeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
LS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
MidiMACS magnetic cell separator | MIltenyi Biotec | 130-042-302 | |
recombinant mouse GM-CSF | Peprotech | 315-03 | |
recombinant human TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | Human TGFβ1 has activity on mouse cells |
Amnis ImageStream X Mark II | Amnis/EMD Millipore | N/A | Imaging flow cytometer; details available at http://www.emdmillipore.com/ |
IDEAS Software | Amnis/EMD Millipore | N/A | Free download (registration required): https://www.amnis.com/index.php/page/Display/login%20%20 |
Cell culture medium | Various | Varies | |
Fetal bovine serum | Various | Varies | |
Cell culture plates | Various | Varies |