Here, a quadriceps muscle specimen is taken from an anaesthetized pig and mitochondria are isolated by differential centrifugation. Then, the respiratory rates of mitochondrial respiratory chain complexes I, II and IV are determined using high-resolution respirometry.
Mitochondria are involved in cellular energy metabolism and use oxygen to produce energy in the form of adenosine triphosphate (ATP). Differential centrifugation at low- and high-speed is commonly used to isolate mitochondria from tissues and cultured cells. Crude mitochondrial fractions obtained by differential centrifugation are used for respirometry measurements. The differential centrifugation technique is based on the separation of organelles according to their size and sedimentation velocity. The isolation of mitochondria is performed immediately after tissue harvesting. The tissue is immersed in an ice-cold homogenization medium, minced using scissors and homogenized in a glass homogenizer with a loose-fitting pestle. The differential centrifugation technique is efficient, fast and inexpensive and the mitochondria obtained by differential centrifugation are pure enough for respirometry assays. Some of the limitations and disadvantages of isolated mitochondria, based on differential centrifugation, are that the mitochondria can be damaged during the homogenization and isolation procedure and that large amounts of the tissue biopsy or cultured cells are required for the mitochondrial isolation.
Mitokondrial biyoenerji ve solunum kapasiteleri permeabilize hücrelerin veya liflerin değil, aynı zamanda izole edilmiş mitokondride sadece incelenebilir. Bu çalışmada, yüksek çözünürlüklü Solunum ölçümleri için diferansiyel santrifüj kullanılarak sağlam iskelet kası mitokondri izole etmek için bir protokol açıklar.
Respirometrik bozulmadan mitokondri izole etmek için, doku homojen hale getirilir ve mitokondri bilinen bir diferansiyel santrifügasyon yöntemi ile izole edilir. Diferansiyel santrifüj yöntemi sıralı santrifüj ilk Pallade tarafından tanıtıldı doku homojenatlarında ve işçiler neredeyse 70 yıl önce 1 (artan bir hızla bir dizi) dayanır. Doku ilk makas kullanılarak kıyılmış ve gevşek tokmak bir cam homojenizatör mekanik olarak homojenize edilir. Daha sonra Homojenat düşük hız ve kesintisiz doku içeren ortaya çıkan pelet, hücresel santrifüj edilirenkaz ve çekirdekler atılır. Daha sonra, üst faz, yüksek hızda birkaç kez santrifüj uygulanır ve mitokondriyal zenginleştirilmiş fraksiyon toplanır. diferansiyel santrifüj yöntemin avantajları mitokondrinin yönündedir izole etmek için: i) yöntemi hızlı ve mitokondri (solunum deneyler mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır) 1-1.5 saat içinde izole edilebilir; ii) ucuzdur; ve iii) çok verimli ve diferansiyel santrifüjleme ile elde edilen mitokondri Solunum tahlilleri için yeterince saf olan. diferansiyel santrifüj yöntemin dezavantajları mitokondrinin olan izole etmek i) mitokondri hasarlı ve homojenizasyon sırasında uncoupled alabilirsiniz; ii) diğer hücresel bileşenleri ile mitokondri (kirlenmesi daha yıkama ek santrifüj adımları ile mitokondriyal pelet) tarafından çözülebilir; iii) diferansiyel santrüfüj adımları sırasında, örneğin farklı mitokondriyal alt popülasyonlar, seçme imkanı, mitAlt Yoğun ile ochondria 7 alınmayabilir; ve iv) mitokondriyal hücresel çevre eksik sadece teorik maksimum solunum ölçülebilir. Solunum deneyleri için mitokondri izole edilmesi için bir başka yöntem, yoğunluk gradyanlı santrifüj 2'dir. göre diğer hücresel bileşenleri izole edilmesi mitokondri neden Bu teknikte, doku ekstraktı sakaroz veya (santrifüj tüpünün dibinde daha yüksek bir yoğunluğa sahip), bir Percoll gradyanı eden bir çözeltiye üzerine yayıldı ve belli bir hızda santrifüj onların yoğunlukları. Bu yöntem genellikle sinaptozomlarda çok düşük kirlenme beyin mitokondri izole etmek için kullanılır. Bununla birlikte, yoğunluk gradyan santrifüjü ile izole edilmiş sıçan karaciğeri mitokondri yüksek diğer hücresel organellerin 3 kirlenir. Bu yöntemin sınırlamaları biri santrifüj tüpünde sukroz gradient mevcut bu yüzden kopma olabilir kiBana mitokondri (ozmotik şok).
doku tipine bağlı olarak; diferansiyel santrifüj ile sağlam mitokondri izolasyonu için dikkat etmeniz gereken bazı önemli faktörler vardır. İlk gerekliliği hassas bir şekilde doku homojenize etmek. böbrek, beyin ve karaciğer gibi yumuşak dokuların homojenleştirme sırasında uygulanan hafif bir mekanik kuvvetleri gerektirir. Bu tür çok daha güçlü mekanik kuvvetler gerektiren kalp ve iskelet kası gibi sert dokularda ile çelişmektedir. Kıyılmış doku önce genelde doku yumuşatmak için homojenizasyona proteinaz ile işlenir. Homojenizasyon ve santrifüj esnasında kullanılan bütün tampon soğuk buz olabilir ve sitozol 4, 5 ile uyumlu iyonik ve ozmotik kuvveti olan bir fizyolojik olarak ilgili pH sahip olmalıdır.
izole mitokondriyal biyoenerjitiklerinin okuyan avantajlarından biri, hücresel plazma zarları permeabi olması gerekmez olmasıdırmitokondrial dış membran bütünlüğünü tehlikeye düşürecek gibi digitonin veya saponin 4, 6 gibi deterjanlar ile lized. İzole mitokondri bir başka avantajı, örneğin, oksijen tüketimi mitokondriyal işlev analizi ile müdahale diğer sitosolik faktörlere bulunmamasıdır. İzole mitokondri ile dezavantajları santrifüj adımları sırasında belirli mitokondriyal popülasyonlarının olası seçimi, homojenleştirme sırasında mitokondriye zarar ve izole mitokondri 7, 8, iyi bir verim elde etmek için biyolojik örnekler, yüksek miktarlarda şartı vardır.
İzolasyon işleminden sonra, mitokondriyal komplekslerinin solunum hızları I, II ve IV-bağımlı (Devletleri 2, 3 ve 4) Yüksek çözünürlüklü Solunum kullanılarak tespit edilir. kompleks I-odaklı solunum, glutamatve malat adenozin difosfat (ADP) eklendi edilmektedir. Kompleks II odaklı solunum için, süksinat ADP ardından eklenir. Kompleks IV odaklı solunum, askorbat ve tetramethylphenylendiamine (TMPD) ADP 9, 10, 11, 12, ardından ilave edilir. Durum 2, tek başına alt-tabakaların mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Durum 3 substratları ve ADP mevcudiyetinde oksijen tüketimi anlamına gelir. Devlet 4 ADP tükenmesi sonra oksijen tüketimi anlamına gelir. Solunum kontrol oranı (RCR) oksijen tüketimi ATP üretimi kuplajın bir dizin ve durum 3 ve durum 4 13, 15 arasındaki oran olarak hesaplanmıştır.
Özetle, biz diferansiyel santrifüj ile fonksiyonel ve sağlam iskelet kası mitokondri izole etmek ve bu izole mitochon kullanmak için bir protokol tarifyüksek çözünürlüklü Respirometrik gibi işlevsel ve biyoenerjik çalışmalar için Dria.
Bu çalışmada, yüksek kaliteli, sağlam ve yüksek çözünürlüklü Respirometrik gibi fonksiyonel çalışmalar için kullanılabilecek diferansiyel santrifüj sıkıca bağlanmış iskelet kası mitokondri izole etmek için bir protokol açıklar.
sağlam ve sıkı birleştiğinde mitokondri izole etmek amacıyla, mevcut protokolü kapsamında dikkate alınması gereken bazı kritik noktalar vardır. iskelet dokusu hasat sonra, hemen buz gibi soğuk mitokondriyal izolasyon tampon dalm…
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Science Foundation (Grant 32003B_127619).
ADP | Sigma | A 4386 | Chemical |
Antimycin A | Sigma | A 8674 | Chemical, dissolve in ethanol |
Ascorbate | Merck | 1.00127 | Chemical |
ATP | Sigma | A 7699 | Chemical |
BSA | Sigma | A 6003 | Chemical |
EGTA | fluka | 3779 | Chemical |
Glutamate | Sigma, | G 1626 | Chemical |
Hepes | Sigma | H 7523 | Chemical |
KCl | Merck | 1.04936 | Chemical |
KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chemical |
K-lactobionate | Sigma | L 2398 | Chemical |
MgCl2 | Sigma | M 9272 | Chemical |
Morpholinopropane sulphonic acid (MOPS) | Merck | 1.06129 | Chemical |
O2k-Core: Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | High-resolution respirometry instrument |
Proteinase, bacterial | Sigma | P 8038 | Chemical |
Sodium azide | Sigma | S2002 | Chemical |
Rotenone | Sigma | R 8875 | Chemical, dissolve in ethanol |
Succinate | Sigma | S 2378 | Chemical |
Schuett homogen-plus semiautomatic homogeniser | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Tissue homogenizer |
Taurine | Sigma | T 8691 | Chemical |
TMPD | Sigma | T 3134 | Chemical |