Summary

Human Lung dendritische cellen: ruimtelijke verdeling en fenotypische Identification in Endobronchiale biopten middels immunohistochemie en flowcytometrie

Published: January 20, 2017
doi:

Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

De longen zijn voortdurend in contact met de buitenomgeving en zijn zeer gevoelig voor zowel onschadelijke deeltjes en microben met het vermogen om ziekte te veroorzaken. Daarom is het essentieel voor het immuunsysteem potente immune responsen tegen binnendringende pathogenen te monteren, maar het is even belangrijk om tolerantie te behouden om geïnhaleerde antigenen die geen ziekte veroorzaken. Potente immune surveillance, wordt het ademhalingssysteem bekleed met een netwerk van immuuncellen, waaronder dendritische cellen (DCs). DCs zijn professionele antigeenpresenterende cellen met het unieke vermogen om naïeve T-cellen te activeren. In menselijke longen, resident DC treedt een antigeen en vervolgens verwerken en transporteren deze naar de long-drainerende lymfeknopen voor presentatie aan en activering van T-cellen 1, 2, 3.

In het menselijke immuunsysteem, kan DCs worden onderverdeeld in verschillende subgroepen, met Distinct maar overlappende functies: cd1c + en CD141 + myeloïde DCs (MDCs) en CD123 + plasmacytoide DCs (PDC's) 4, 5. Terwijl de meest gedetailleerde kennis over humane DCs afkomstig uit studies in bloed, is het nu duidelijk dat de menselijke longen ook haven zeldzame populaties van DC subsets met T-cel stimulerende capaciteit 6, 7, 8, 9. Echter, accumuleren gegevens blijkt dat immuuncellen, zoals DCs verschillen in frequentie, fenotype en functie afhankelijk van de anatomische locatie 10. Derhalve is het belangrijk om immuuncellen bestuderen van de desbetreffende weefsel hun bijdrage aan lokale immuniteit en tolerantie begrijpen. Bij elkaar genomen, dit onderstreept de noodzaak om long-resident DCs studeren bij de aanpak van longziekten, ondanks het bloed DC's die meer direct beschikbaar en toegankelijk bij mensen.

De eerste studies die long-DCs resident bij mensen onderzocht zich primair op morfologie en de expressie van één markers, zoals HLA-DR en CD 11 c, in weefselsecties middels immunohistochemie 11, 12, 13. Daarentegen recentere studies doorgaans gebruikt flowcytometrische analyses verschillende immuuncelsubklassen bestuderen. Aangezien het moeilijk is om een ​​celoppervlak marker die uniek identificeert een bepaald DC deelverzameling vinden potentiële beperking van studies die alleen vier kleuren flowcytometrie is het risico van het opnemen celpopulaties met gelijke fenotypische markers als DCs. Zo wordt CD11c uitgedrukt op alle myeloïde DC en de meeste monocyten. Anderzijds, in studies toepassing geavanceerdere flowcytometrie panelen werden goedaardige longweefsel van chirurgische resectie patiënten typisch gebruiktxref "> 10, 14, 15, 16, hoewel het onduidelijk is of deze zeldzame populaties werkelijk representatief DCs bij gezonde proefpersonen. Kortom, zijn studies grotendeels beperkt door het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars.

Om een ​​aantal van deze beperkingen te overwinnen, dit werk wordt beschreven hoe u een gedetailleerde analyse van de ruimtelijke verdeling en een fenotypische identificatie van DCs in mucosale endobronchiale biopsieën verkregen bij gezonde vrijwilligers die een bronchoscopie ondergaan, uit te voeren. Verschillende kleine biopten kunnen worden verzameld van elk individu en vervolgens kan worden ingebed voor het snijden en analyse met behulp van immunohistochemie of enzymatisch verteerd voor geavanceerde flowcytometrische analyse. Via long weefsel in de vorm van endobronchiale biopsieën verkregen bronchoscopies verleent het voordeel dat het mogelijk de st voerenUdy op gezonde vrijwilligers, anders dan open chirurgie van de longen die voor de hand liggende redenen, is beperkt tot patiënten die thoracale chirurgie. Bovendien het weefsel dat wordt bemonsterd tijdens een bronchoscopie van gezonde vrijwilligers fysiologisch normaal, in tegenstelling tot een niet-getroffen gebied van longweefsel bij patiënten met een longziekte. Anderzijds, de biopsieën zijn klein en het aantal cellen teruggehaald, zelfs als pooling meerdere biopten, beperkt het soort analyses kunnen worden uitgevoerd.

Hoewel de huidige werk richt zich op DCs, de beschreven kan direct worden uitgebreid methoden om andere (immuun) cellen van belang dat in het menselijk mucosale longweefsel wonen bevatten. Bovendien zijn de protocollen zijn ook direct van toepassing op monsters verkregen van patiënten die lijden aan pulmonaire ziekten waarbij bronchoscopie hoort bij stellen van de diagnose, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD), sarcoïdose, of longkanker.

Protocol

LET OP: Dit onderzoek werd in Umeå, Zweden goedgekeurd door de regionale Ethical Review Board. 1. bronchoscopie monstername Endobronchiale biopten van Mensgebonden Verkrijgen geïnformeerde toestemming van alle deelnemers. Behandel patiënten met orale midazolam (4-8 mg) en intraveneuze glycopyrronium (0,2-04 mg) 30 minuten vóór de bronchoscopie. Solliciteer lokale verdoving met lidocaïne in het strottenhoofd en de bronchiën. Dat het onderwerp gorgelen met ~ 3 ml li…

Representative Results

Studies karakteriseren ademhalingssysteem weefsel-resident immuuncellen, zoals DCs, beperkt, voornamelijk vanwege het feit dat operatief verwijderd of volledig menselijk longweefsel schaars. Hier, een minder invasieve werkwijze voor het verkrijgen van longweefsel endobronchiale biopsies (EBB) van gezonde vrijwilligers en ontwikkelde protocollen bij de immuuncellen in het weefsel cytometrie studie gebruikt immunohistochemie of flow geschetst. <p class="jove_content" fo:keep-together.w…

Discussion

Dit document beschrijft hoe u een gedetailleerde ruimtelijke en fenotypische karakterisatie van longweefsel-ingezeten DCs bij gezonde mensen te genereren met behulp van immunohistochemie en flowcytometrie op endobronchiale mucosale biopten tijdens bronchoscopie verzameld. In de volgende paragrafen kritische stappen in het protocol worden in detail besproken.

Kritische Stappen met het Protocol

Snijden en immunohistochemie: Het is cruciaal om de biopsie blokken bij -2…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag de vrijwilligers die klinisch materiaal hebben bijgedragen aan dit onderzoek bedanken. We zijn ook dankbaar voor het personeel van het ministerie van Volksgezondheid en Clinical Medicine, Division of Medicine / Respiratory Medicine, University Hospital, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) voor het verzamelen van alle klinische materiaal.

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan AS-S van de Zweedse Research Council, de Zweedse Hart-Lung Foundation, de Zweedse Stichting voor Strategische Research, en het Karolinska Institutet.

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

  1. Kopf, M., Schneider, C., Nobs, S. P. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol. 16 (1), 36-44 (2015).
  2. Condon, T. V., Sawyer, R. T., Fenton, M. J., Riches, D. W. Lung dendritic cells at the innate-adaptive immune interface. J Leukoc Biol. 90 (5), 883-895 (2011).
  3. Lambrecht, B. N., Hammad, H. Biology of lung dendritic cells at the origin of asthma. Immunity. 31 (3), 412-424 (2009).
  4. Schlitzer, A., McGovern, N., Ginhoux, F. Dendritic cells and monocyte-derived cells: Two complementary and integrated functional systems. Semin Cell Dev Biol. 41, 9-22 (2015).
  5. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), e74-e80 (2010).
  6. Demedts, I. K., Brusselle, G. G., Vermaelen, K. Y., Pauwels, R. A. Identification and characterization of human pulmonary dendritic cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (3), 177-184 (2005).
  7. Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D. Identification rare-event detection and analysis of dendritic cell subsets in broncho-alveolar lavage fluid and peripheral blood by flow cytometry. Front Biosci. 8, s1175-s1180 (2003).
  8. Masten, B. J., et al. Characterization of myeloid and plasmacytoid dendritic cells in human lung. J Immunol. 177 (11), 7784-7793 (2006).
  9. Ten Berge, B., et al. A novel method for isolating dendritic cells from human bronchoalveolar lavage fluid. J Immunol Methods. 351 (1-2), 13-23 (2009).
  10. Yu, C. I., et al. Human CD1c+ dendritic cells drive the differentiation of CD103+ CD8+ mucosal effector T cells via the cytokine TGF-beta. Immunity. 38 (4), 818-830 (2013).
  11. Nicod, L. P., Lipscomb, M. F., Toews, G. B., Weissler, J. C. Separation of potent and poorly functional human lung accessory cells based on autofluorescence. J Leukoc Biol. 45 (5), 458-465 (1989).
  12. Sertl, K., et al. Dendritic cells with antigen-presenting capability reside in airway epithelium, lung parenchyma, and visceral pleura. J Exp Med. 163 (2), 436-451 (1986).
  13. van Haarst, J. M., de Wit, H. J., Drexhage, H. A., Hoogsteden, H. C. Distribution and immunophenotype of mononuclear phagocytes and dendritic cells in the human lung. Am J Respir Cell Mol Biol. 10 (5), 487-492 (1994).
  14. Schlitzer, A., et al. IRF4 transcription factor-dependent CD11b+ dendritic cells in human and mouse control mucosal IL-17 cytokine responses. Immunity. 38 (5), 970-983 (2013).
  15. Yu, Y. A., et al. Flow Cytometric Analysis of Myeloid Cells in Human Blood, Bronchoalveolar Lavage, and Lung Tissues. Am J Respir Cell Mol Biol. , (2015).
  16. Haniffa, M., et al. Human tissues contain CD141hi cross-presenting dendritic cells with functional homology to mouse CD103+ nonlymphoid dendritic cells. Immunity. 37 (1), 60-73 (2012).
  17. Britten, K. M., Howarth, P. H., Roche, W. R. Immunohistochemistry on resin sections: a comparison of resin embedding techniques for small mucosal biopsies. Biotech Histochem. 68 (5), 271-280 (1993).
  18. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat Rev Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  19. Baharom, F., et al. Dendritic Cells and Monocytes with Distinct Inflammatory Responses Reside in Lung Mucosa of Healthy Humans. J Immunol. 196 (11), 4498-4509 (2016).
  20. Salvi, S., et al. Acute inflammatory responses in the airways and peripheral blood after short-term exposure to diesel exhaust in healthy human volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 159 (3), 702-709 (1999).
  21. Schon-Hegrad, M. A., Oliver, J., McMenamin, P. G., Holt, P. G. Studies on the density, distribution, and surface phenotype of intraepithelial class II major histocompatibility complex antigen (Ia)-bearing dendritic cells (DC) in the conducting airways. J Exp Med. 173 (6), 1345-1356 (1991).
  22. Saeys, Y., Gassen, S. V., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nat Rev Immunol. 16 (7), 449-462 (2016).

Play Video

Cite This Article
Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

View Video