Optimierte Analyse von<em> In Vivo</em> und<em> In Vitro</em> Hepatosteatose
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
Adipositas ist eine wachsende Gesundheitsproblem in den entwickelten und den Entwicklungsländern. Es wurde eines der koexistierenden Bedingungen 1 häufig mit nicht – alkoholische Fettleber (NASH), mit einer Prävalenz im Bereich zwischen 30 und 100 Prozent in NASH Patienten in Verbindung gebracht werden berichtet. Aufgrund der starken Korrelation zwischen Fettleber und Fettsucht, Diät-induzierte fettleibig (DIO) Mausmodelle werden häufig zur Untersuchung der komplexen molekularen Mechanismen im Zusammenhang mit der Entwicklung von NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 verwendet. Hepatosteatose ist das früheste Stadium von NAFLD, und es kann zu nichtalkoholische Steatohepatitis (NASH), Zirrhose fortschreiten und schließlich Leberkrebs 7. Daher ist das allgemeine Ziel dieser Methode Tier- und Zellmodellen der hepatischen steatotic Bedingungen zu erzeugen und zu provide detaillierte Protokolle für die effiziente und genaue Lipidmessung. Diese Modelle und Messungen sind auch geeignet für die Untersuchung von anderen Stoffwechselstörungen, wie Insulinresistenz und Typ-2-Diabetes.
Da Fettleibigkeit identifiziert wird einer der wichtigsten Risikofaktoren für NAFLD, eine fettreiche, High-Saccharose-Diät (HFHS), die den Western-Stil hohen Fett-Diät imitiert sein wird verwendet, Fettleibigkeit bei Mäusen zu induzieren. Anschließend kann der Grad der Lebersteatose verschiedenen Methoden beurteilt werden. Erstens, Körpergewicht und Körperzusammensetzungsanalyse mit Kernspinresonanz (NMR) zeigen die Lipidakkumulation während der Fütterung. Die Fettmasse und Muskelmasse in einem nicht-invasiv und in Echtzeit Weise quantifiziert werden.
Zusätzlich wird die Kernspintomographie (MRI) verwendet, um sowohl die Ganzkörper und die Leber Fettverteilung zu zeigen. Das Graustufensignal des MRI-Analyse kann in einem lesbaren Pseudofarbbild umgewandelt werden, und die Intensität derdie Graustufen- und Farb ist Hemi-quantifizierbar. Diese Technologie bietet einzigartige Vorteile für die Messung der Lipidakkumulation in lebenden Tieren. Zweitens ist die histologische Analyse der Leber am häufigsten verwendete Methode Hepatosteatose zu bestimmen. Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung liefert histologischen Daten wie Hepatozyten Morphologie und Makrophageninfiltration, während Oil Red-O-Färbung, die Größe und Position der Lipidtröpfchen in Hepatozyten zeigt. Drittens ist der Lipidgehalt Analyse Chloroform / Methanol-Extraktion unter Verwendung eine genaue und quantitative Messung von Leberlipiden. Gesamt-Triglycerid-und Cholesterinspiegel kann mit biochemischen Methoden gemessen werden. Wichtig ist, dass Lipid-Extraktionsanalyse und Oil Red O Färbung auch in genetisch manipulierten oder pharmazeutisch behandelten Hepatozyten verwendet werden.
Der Vorteil des vorliegenden Verfahrens ist die Verwendung von mehreren optimiert Ansätze hepatischen steatotic Modelle zu erzeugenund umfassend die Phänotypen charakterisieren sowohl in vivo und in vitro. Die DIO Mausmodelle können die Pathologie und metabolischen Phänotyp der menschlichen Fettleberkrankheit rekapitulieren. Andere Stoffwechselparameter beim Menschen können in diesem Modell als auch 8 repliziert werden. Die Erzeugung des steatotic Hepatozyten-Modell in Reaktion auf hohe Glukose plus Insulin ist effizient, nützlich und überwindet die Begrenzung der kostspielig und zeitraubend Maus funktionieren. Zusammengenommen sind diese Verfahren ausreichend und notwendig für die Untersuchung von Leberlipidstörungen und Insulinresistenz bei Nährstoff Überlastung.
Protocol
Representative Results
Discussion
NASH ist eine Reihe von progressiven Lebererkrankungen, die mit metabolischem Syndrom assoziiert ist, Fettleibigkeit, Insulinresistenz oder Typ – 2 – Diabetes mellitus (T2DM) 11. Das Markenzeichen von NAFLD ist Steatose, die Anhäufung von Lipid in Hepatozyten. Hier wird ein Spektrum von Verfahren vorgestellt, die Phänotypen und die Parameter der Lebersteatose Verwendung DIO Mäuse und Maus primären Hepatozyten zu charakterisieren. Dieses Verfahren könnte hilfreich sein, die molekularen Mechan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
- Angulo, P. Medical progress – Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346 (16), 1221-1231 (2002).
- Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65 (7), 1904-1915 (2016).
- Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13 (4), 376-388 (2011).
- Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146 (2), 539-549 (2014).
- Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3 (2), 87-98 (2006).
- Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116 (6), 1494-1505 (2006).
- Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332 (6037), 1519-1523 (2011).
- Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (1), 35-44 (2011).
- Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35 (38), 10058-10069 (2014).
- Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64 (2), 425-438 (2016).
- Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (6), 330-344 (2013).
