Onderzoek van Host Phenotypes in<em> Gambusia affinis</em> Na een behandeling met antibiotica

Summary

Deze studie omvat werkwijzen effecten op een modelvis gastheer na verandering van de huid en darmen microbiome gemeenschappen compositie van een antibioticum onthullen.

Abstract

The commonality of antibiotic usage in medicine means that understanding the resulting consequences to the host is vital. Antibiotics often decrease host microbiome community diversity and alter the microbial community composition. Many diseases such as antibiotic-associated enterocolitis, inflammatory bowel disease, and metabolic disorders have been linked to a disrupted microbiota. The complex interplay between host, microbiome, and antibiotics needs a tractable model for studying host-microbiome interactions. Our freshwater vertebrate fish serves as a useful model for investigating the universal aspects of mucosal microbiome structure and function as well as analyzing consequential host effects from altering the microbial community. Methods include host challenges such as infection by a known fish pathogen, exposure to fecal or soil microbes, osmotic stress, nitrate toxicity, growth analysis, and measurement of gut motility. These techniques demonstrate a flexible and useful model system for rapid determination of host phenotypes.

Introduction

Er is vastgesteld dat antibiotica het menselijk microbiome leidt tot dysbiosis kunnen verstoren, wat betekent dat een microbiële gemeenschap onbalans. Compositionele veranderingen microbiota na antibiotica is aangetoond dat de diversiteit van de gemeenschap te verlagen, verlagen belangrijke leden, en veranderen door metabolisme, met name in de darm ^{1, 2.} Antibioticum verstoring van de darm microbiome kan kolonisatieweerstand verminderen Clostridium difficile ^{3, 4} en ⁵ Salmonella.

Daarnaast is de verstoring van de microbiota in verband gebracht met de ontwikkeling van vele syndromen en ziekten bij mensen (bijvoorbeeld met antibiotica geassocieerde enterocolitis, ontstekingsdarmziekte, stofwisselingsziekten, enz.). Antibiotica worden ook op grote schaal toegepast in de landbouw als groeibevorderaar invee en pluimvee productie ^6. Het gebruik van deze krachtige instrumenten niet zonder neveneffecten, die blijkt uit de snelle opkomst van antibioticaresistentie, evenals de effecten van een verstoorde microbiome heeft met bewoonde gastheer. Vele studies hebben aangetoond dat breed-spectrum antibiotica heeft langdurige gevolgen voor de structuur en functie van de microbiota, maar de bijwerkingen van een antibioticum verstoord microbiome invloed ontvangende fysiologie alleen beschouwingen die nog moeten worden ondersteund.

Het samenspel tussen de gastheer, microbiota, en antibiotica is nog lang niet begrepen in een bondige wijze. Een eenvoudig en soepel model voordelig om licht te werpen op de zeer complexe zoogdiersysteem. Mucosale oppervlakken bij mensen, zoals de darm, haven de hoogste dichtheid en diversiteit van microben, en ook de meest intieme microbe-gastheer interacties. De mucosale huid microbiome vis aanbiedingen several voordelen als een modelsysteem. De Teleostei (beenvissen) is één van de eerste lijnen divergeren in de zin dat teleosten vertebraten zowel aangeboren en verworven immuunsystemen die samen geëvolueerd relatie commensale bacteriële ^7. Vissenhuid deelt vele eigenschappen met type 1 mucosale oppervlakken van zoogdieren, zoals fysiologische functies, immuniteit componenten en een opstelling van slijm producerende cellen ^8. De externe locatie van de vis huid slijmvliesoppervlak biedt een microbiome makkelijk te manipuleren en experimenteel monster.

De Westerse mosquitofish, Gambusia affinis (G. affinis), is een model vis die is gebruikt in het verleden voor het bestuderen van de paring en toxicologie ^{9, 10, 11.} Gezien de geringe omvang, de bevolking overvloed in het wild als een invasieve soort, m inimal zorg kosten en winterharde de natuur, hebben we G. Affinis ontwikkeld als een mucosale microbiome model. Verder Gambusia delen de fysiologie van de bevalling jong met levendbarende zoogdieren, dat is ongewoon in vissoorten te leven. We voltooiden de meest uitgebreide studie op het moment van vissenhuid normale microbiota met behulp van 16S profileren met Gambusia ^12. Verdere werkzaamheden aangetoond drie negatieve effecten op de host na verstoring van de huid en de darmflora met behulp van een breed-spectrum antibioticum ^13.

Vijf verschillende effecten werden in de vis volgende antibiotica blootstelling onderzocht. De meest gevestigde gastheer voordeel van de microbiome concurrerend uitsluiting van pathogenen. De vis ziekteverwekker Edwardsiella ictaluri is bekend dat uitbraken van enterische bloedvergiftiging veroorzaken commerciële meerval landbouwbedrijven ^14. E. ictaluri is ook aangetoond dat dodelijk infecteren zebravisclass = "xref"> ^{15, 16} en ¹⁷ Gambusia. Een probleem met dit pathogeen uit de waterkolom kan dienen als een maat voor uitsluiting. Als vergelijking gevoeligheid voor individuele pathogeen, werd overleving bij blootstelling aan een hoge dichtheid van gemengde organismen ook uitgevoerd. Uitwerpselen en organisch-rijke bodem werden gebruikt als veelvoorkomende bronnen van microbiële gemeenschappen.

Een andere gevestigde rol van de bacteriële darm gemeenschap voert is voedingsstoffen verwerken en energie oogsten, hetgeen van invloed van de algemene nutritionele opname voor de gastheer. Als een grove meting van de voeding, werd vis lichaamsgewicht vergeleken vóór en na een maand van te worden gevoed met een standaard dieet. Antibiotica behandeld vis als een gemiddelde verloren gewicht, terwijl de controle vis gemiddeld gewicht gekregen over de maand. Het mechanisme voor dit gebrek aan gewichtstoename onduidelijk. Een mogelijke factor is transittijd van voedsel in de darm. Een GI motiliteit methode werd aangepast van de zebravis (Adam Rich, SUNY Brockport, persoonlijke communicatie) om de doorvoer te bepalen. Het is nog niet vastgesteld of antibiotica behandeld vissen hebben een veranderde transittijd.

Een gemeenschappelijke uitdaging in de natuurlijke omgeving ervaren door alle organismen, met name vissen, is osmotische stress. Gambusia bleken zich snel aanpassen aan acuut benadrukt in hoge concentraties zoutgehalte ^18. Verrassend, vissen met een antibioticum veranderd microbiome tentoongesteld verlaagd overleven op een hoog zout stress. Het mechanisme voor dit nieuwe fenotype wordt onderzocht. Een andere veel voorkomende op aquatische dieren, met name in aquaria, is giftig vormen van stikstof (ammoniak, nitraat en nitriet). Survival nitraat was niet significant verschillend tussen antibiotica behandelde en controle vis. De in dit manuscript werkwijzen kunnen worden gebruikt met Gambusia of soortgelijke vis modelorganismen, zoals zebravis en medaka, om fenotypen in de vis volgende experimentele manipulatie te meten.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van IACUC protocollen, genummerd 14-05-05-1018-3-01, 13-04-29-1018-3-01 en 14-04-17-1018-3-01. 1. Dierlijke Collection, Handling, en ethische zorg Verzamel Gambusia affinis uit het veld website (identificatie gids op http://www.sms.si.edu/irlspec/Gambusia_affinis.htm) met behulp van een kleine dip net en plaats in een 19 L emmers. Gebruik visuele inspectie om soorten te identificeren. Rest vis voor 1-2 d in een emmer…

Representative Results

Een algemeen schema van het experimentele systeem om vis ontvangende effecten van antibiotica blootstelling 13 studie is weergegeven in figuur 1A en omvat de techniek voor het extraheren van de huid (Figuur 1B) en dierlijke (figuur 1C) microbiomes uit de vis. Drie dagen werd geselecteerd als het antibioticum periode van blootstelling omdat eerdere gegevens blijkt dat, terwijl de totale huid kweekbare aantal in het…

Discussion

Sommige uitdagingen vereisen een rustperiode in schone APW na behandeling met antibiotica voor de drug te worden uitgeput in vis weefsels. Indien de rusttijd wordt overgeslagen dan antibioticum aanwezig kan verwarren de resultaten, vooral wanneer de bepaling omvat blootstelling aan bacteriën. Om de effecten van een veranderde microbiome samenstelling zonder grote veranderingen in het aantal microben op de host, voorlopige experimenten controle microbiome samenstelling (16S profiling of volledige genoomsequenties) en be…

Materials

Rifampicin	Calbiochem	557303-1GM
Sodium Nitrate	Sigma Aldrich	S5506
Fluorescein-labeled 70 kDa anionic dextran	ThermoFisher Scientific	D1823
PBS tablets	Calbiochem	6500-OP	tablets dissolve in water to make phosphate-buffered saline