这手稿描述了一种简单的方法来测量吞噬体的pH值和面积以及使用比率量度指示器seminaphthorhodafluor(SNARF)-1,或S-1人和小鼠嗜中性粒细胞的胞质pH值。这是使用活细胞共聚焦荧光显微镜和图像分析来实现的。
中性粒细胞是宿主先天防御的关键,因此,构成医学研究的一个重要领域。吞噬,细胞内的车厢中吞噬颗粒的杀戮和消化发生,对于那些需要精确调节中性粒细胞杀灭病原体的主要舞台。吞噬体的pH是仔细控制,反过来调节抗微生物的蛋白酶活性的一个方面。许多荧光pH敏感的染料已被用于可视化的吞噬体环境。 S-1具有比其它pH敏感染料,包括它的双发射光谱,其光漂白性和其高的pKa几个优点。使用这种方法,我们已经表明,中性粒细胞吞噬是相较于其他吞噬细胞异常碱性。通过使用染料的不同生物化学缀合,吞噬体可以从细胞质划定使得在吞噬体的大小和形状的变化进行评估。这使得˚F或进一步的监测离子的运动。
中性粒细胞是人体内最丰富的先天免疫细胞。它的主要功能包括巡逻血流和吞噬并消化,它可能在被称为吞噬1,2的过程遇到外来颗粒。这些颗粒中降解称为吞噬细胞内舱。中性粒细胞NADPH氧化酶的亚型NOX2,活化引发生物化学反应的级联,在病原体死亡高潮。 NOX2蛋白质亚基进行到形成在吞噬体膜3的电子传递链复合体。一旦被激活,它从NADPH穿过膜传输电子到分子氧吞噬体内的,从而产生超氧阴离子和进一步的活性氧物种。这被称为呼吸爆发,并且它被认为是用于有效微生物杀伤和消化2必不可少</suP>。然而,负电荷穿过膜这个独特的运动很快就会失活NOX2,如果它不是由正电荷移动的和/或负电荷移出吞噬的补偿。已经公认的是大多数在中性粒细胞电荷补偿由质子通道HVCN1 4,5进行。这个信道允许质子向下从细胞质到吞噬体它们的电化学梯度的被动运动。质子浓度通过pH反射,所以对于氧化酶活性的给定电平,测量pH在吞噬体可以提供在电荷补偿质子和非质子途径的相对参与信息。
的人嗜中性白细胞吞噬体具有大约8.5 20-30分钟吞噬5后的碱性pH值。这意味着在NOX另外的非质子离子通道的存在2诱导的电荷补偿,作为融合和的酸性颗粒和鞋底补偿由HVCN1的内容物的释放将维持酸性环境,而相比之下,所观察到的。离子的移动,以补偿该负电荷也可经由渗透施加在吞噬体大小的变化。这些存在于高生理浓度的中性粒细胞可以是离子:钾离子已经显示出移动到吞噬体6,和氯化物离子的运动是另一个候选为嗜中性粒细胞功能7重要。
pH值在吞噬体的调节是用于抗微生物蛋白酶活性5是至关重要的。髓过氧化物酶(MPO)似乎具有最佳活性在pH 6,而对于组织蛋白酶G和弹性蛋白酶的最佳水平为pH 7-9和pH 8-10,分别为5。因此,在吞噬体的pH瞬时变化可以针对不同的酶,以提供有趣的活动龛ction。了解pH值如何参与嗜中性粒细胞杀死微生物可以提供新颖的嗜中性粒细胞增强微生物剂的设计的有用信息。
中性粒细胞吞噬体是一种高活性的环境。这使得难以准确评估pH值,因为染料可能容易被氧化,从而导致技术假象。从历史上看,异硫氰酸荧光素(FITC)已选择的染料来测量细胞内pH 8,9。然而,也有一些缺点为其测量中性粒细胞吞噬小体的pH使用。它具有6.4 10的pKa,这意味着它只能精确地被用于pH水平评估为5至7.5 8,因为它饱和在pH <8 11。由于嗜中性粒细胞吞噬体pH值可以变得更加碱性5,FITC不能捕获全面的潜在的pH变化。进一步signifi嗜中性粒细胞中的上下文中倾斜问题用FITC是,它被认为是由MPO 12光漂白。的MPO抑制剂,叠氮化钠,可以用来限制光漂白13,但它已经表明,叠氮化钠直接降低了pH值吞噬体中的MPO无关的方式,并因此在这样的测定5不当使用。
相对于其他细胞内的染料,S-1具有7.5 10相对高的pKa。在酸性条件下,该分子是质子化的并且当在488纳米或以上激发产生560和600纳米之间的发射信号。当在分子中更多的碱性条件下脱质子化,发射波长为600纳米。在这两个波长的荧光强度的比例表示发光移,这是更比单一荧光测量可靠,因为它是由荧光团浓度和细胞结构的影响。 S-1可以缀合至抗原性材料,例如酵母聚糖14,虽然热灭活(HK) 白色念珠菌是优选的,因为较大的表面积给出了更一致的荧光读数。
我们也使用这种方法的修改来研究pH值随时间的变化( 图3)5。此胞质pH值的测定方法可容易地应用于其它类型的细胞中,与多种碱性吞噬体14中别处描述15,16,和细胞。
一旦适当的试剂,显微镜设置和校准实验设置,这种方法是相对简单的执行。的关键步骤包括:与S-1标记的念珠菌 ,以确保不存在染料的超载,校准和分析图像。
S-1是适合于碱性pH环境的试剂,它是嗜中性粒细胞21特别重要,但限制在某些细胞类型及其用途。有关详细的酸性环境,如巨噬细胞吞噬体,SNARF-4,或S-4,是更合适的,因为其下的pKa 22。此外,对于更精确的读数细胞质,最好是使用S-4,作为用于S-1的标准曲线示出了荧光比开始低于pH 6高原( 图3)。其他染料,如2' ,7'-二(2-羧乙基)-5-(和-6) – 羧基荧光素(BCECF)或红色的pHrodo也可能更适合在CONT分机,预计将是酸性的。然而,胞浆染色仍是必要的正确识别含念珠菌的吞噬的。
一个吞噬体pH指示剂的一个重要特征是,它是不可逆的通过反应性吞噬体环境改变。 S-1似乎是中性粒细胞性环境。这是通过Levine 等人示出。 5(参见参考文献5补充视频4),其表明由Hvcn1吞噬和S-1标记的念珠菌粒子的随后的释放– / –嗜中性粒细胞。当吞噬,颗粒从黄色/橙色到红色(中性至碱性pH下)转动时,但是当粒子通过嗜中性粒细胞释放,它返回到原来的颜色。
重要的是要提一些使用S-1相关的限制是非常重要的。这染料具有两个发射光谱允许比率MEAS的事实urement是一个优势,但需要专门的设备来获取图像;用于实验的显微镜必须能够记录同时或与非显着的时间延迟的两个图像。作者假设,研究人员在尝试此协议利用共聚焦显微镜有经验,或访问训练有素的专业人员。我们无法列出所有的特定显微镜参数,因为它们会为每个显微镜不同,需要由研究人员进行优化。缀合到S-1的乙酰氧基甲基酯,其允许染料扩散进入细胞的细胞质是通过在细胞的细胞质中的非特异性酯酶降解以形成荧光分子。酯酶,如碱性磷酸酶,存在人血清和胎牛血清,其用于补充细胞培养基英寸因此,在其中所述细胞加载S-1-AM(第4.5节)所述介质必须不含有血清。如果使用需要更多的营养RIC细胞,这可能具有挑战性H培养基,以维持它们比贯穿本协议中使用的平衡盐溶液。类似地,其他荧光培养基组分,如酚红,可与S-1的测量干扰。
图3中的误差棒表明,有在各pH的比率测量的一些变化。合适数目的每个实验的重复(至少n = 3)并且在每个单次实验中作为许多单个的测量需要克服间液泡的变化。因此建议测量至少100个吞噬体对于每种条件并显示到仅包含一个念珠菌尽可能多的吞噬体区域的pH。用于定量应该是那些已完全吞噬念珠菌粒子( 即,那些完全被细胞质包围)将待测量的吞噬体。为了减轻防止意外偏差在用于定量细胞/吞噬体的选择,所有的分析应而进行盲目的实验条件。
在这里,我们的全血接着等离子体层的离心分离通过密度梯度葡聚糖沉降描述嗜中性粒细胞的分离。我们使用这个技术,因为它快速和有效地产生嗜中性粒细胞的纯(> 95%)的人口,虽然也有可用的其它方法,例如通过其他密度梯度公式或使用专门的试剂盒与抗体或磁中性粒细胞的阴性选择全血离心珠。然而,后者可以是谁经常嗜中性粒细胞中分离大多数组昂贵。另外,我们使用抗凝血剂肝素的血液收集管,而其它研究人员可能更习惯于使用乙二胺四乙酸(EDTA)或酸式柠檬酸盐钠(ACD)。由于有许多不同的方法可供选择,它是由研究者的个人喜好。
此外,分离和操纵嗜中性粒细胞时它们应与一些小心处理以避免过度活化。预防措施包括:使用只塑料器皿,没有玻璃;过滤灭菌的所有缓冲区,以除去任何污染的内毒素;当纺纱嗜中性粒细胞确保离心机是很好的平衡,避免过度振动;限制尽可能时间中性粒细胞保留在离心后的颗粒;不保持在超过5×10 6个 / mL的溶液的嗜中性粒细胞;和隔离后尽快进行实验。
可以适于该方法通过使用显微镜加热的阶段设定为37℃和从相同位置拍摄快照每隔30-60秒至测量随时间的pH和吞噬体面积的变化,作为用于校准的步骤进行说明。它也可以在理论上适合于高通量的实验,例如在96孔板中,并进行流式细胞术实验,其中S-1可以被用作pH指示剂23。然而,在这些设置,强调个人的细胞活性是通过在细胞群更具全球性的影响所取代。
这种方法旨在提供一个比较简单的实验装置在个别研究人员可以适应,以满足他们感兴趣的领域。研究人员可能希望探索嗜中性粒细胞吞噬体的pH值和面积,同时还测量其它离子的移动,例如,细胞内钙浓度。有几种荧光钙指标容易地用于共焦显微镜,如印1,其还具有在400和475nm处24双发射光谱。这些发射波长不与S-1的发射光谱重叠,但激发波长是在光谱,其可以破坏细胞的紫外线(UV)端,和一个紫外激光是不是在所有显微镜普遍。不同指标的全面审查测量细胞内钙通量由高桥等人所覆盖。 25和希尔森等。 26。
总之,存在可使用不同的荧光染料如生菜等来测量pH为吞噬体的其它方法。已经证明13以及其它基团27,28。其他研究人员也使用S-1来测量pH为胞质29或吞噬体的pH 14。然而,该协议是在同时测量两个胞质溶胶和吞噬体的pH值,这提供了机会来观察吞噬体的横截面面积的变化和野生型和Hvcn1区分独特– / –小鼠嗜中性粒细胞,和具有和不具有人嗜中性白细胞工作NADPH氧化酶。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由好心威康信托,生物技术和生物科学研究理事会和欧文·乔夫纪念奖学金资助。
Candida albicans ATCC 10231 Vitroids 80 CFU | Sigma-Aldrich | RQC14003-10EA | Place directly on a spread agar plate according to the manufacturer's instructions |
YPD broth | Sigma-Aldrich | Y1375 | Follow manufacturer's instructions, various providers exist |
Dextran Clinical grade MW = 200,000-300,000 | MP Biomedicals | 2101514 | Use gloves |
Heparin Sodium solution for infusion (preservative free), 1,000IU/ml | Fannin, Wockhardt UK Ltd | FP1077 | We purchased from UCH inpatient pharmacy |
SNARF-1 Carboxylic Acid, Acetate, Succinimidyl Ester – Special Packaging | Thermo Scientific/Invitrogen | SS22801 | Use gloves |
5-(and-6)-Carboxy SNARF-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Thermo Scientific/Invitrogen | C1272 | Use gloves |
Vivaglobin human IgG 160mg/ml solution | CSL Behring | received as a gift | Various providers exist |
Normal mouse serum | Abcam | ab7486 | Various providers exist |
Lymphoprep (density gradient medium) | Alere Ltd | 1114547 | Keep sterile and away from direct sunlight, can be substituted by Ficoll-Paque |
Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | Toxic, use gloves, various providers exist |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Toxic, use gloves, various providers exist |
4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
Magnesium sulphate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Various providers exist |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P9791 | Various providers exist |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Various providers exist |
Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | Various providers exist |
Absolute Ethanol | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
Diphenylene iodonium (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Various providers exist |
Zinc chloride | Sigma-Aldrich | 208086 | Various providers exist, do not dilute in phosphate based buffers as it will precipitate |
Poly L lysine | Sigma | P4707 | Various providers exist |
Laser scanning confocal microscope (Zeiss LSM 700) | Carl Zeiss | The microscope must be able to excite at 555nm and measure emission at two channels simultaneously (560-600nm, >610nm) | |
Ibidi µ slide 8 well ibiTreat | Thistle Scientific | IB-80826 | Other appropriate imaging dishes can be substituted |
Fluorodish Cell Culture Dish-35mm, 23mm well | World Precision Instruments | FD35-100 | Other appropriate imaging dishes can be substituted, different sizes are available |
Soniprep 150 | MSE | Any appropriate sonicator will suffice | |
TC20 Automated Cell Counter | BioRad | Various providers exist | |
1.5ml Protein LoBind Tubes | Sigma-Aldrich | Z666505-100EA | Specially used as Candida can stick to normal eppendorfs |