Dit protocol beschrijft de generatie van muizen orthotope blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen en de monitoring van tumorgroei.
Dit protocol beschrijft de vorming van blaastumoren bij vrouwelijke C57BL / 6J muizen, waarbij de muis blaaskanker cellijn MB49, dat gemodificeerd menselijk Prostaat Specifiek Antigeen (PSA) scheiden, en de procedure voor de bevestiging van tumor implantatie. In het kort worden muizen verdoofd met behulp van injecteerbare geneesmiddelen en zijn gemaakt te leggen in de dorsale positie. Urine wordt vrijgemaakt uit de blaas en 50 pl poly-L-lysine (PLL) wordt langzaam gedruppeld met een debiet van 10 ul / 20 s onder toepassing van een 24 G IV katheter. Het wordt in de blaas gedurende 20 min door stoppering de katheter. De katheter wordt verwijderd en PLL hebben verlaten lichte druk op de blaas. Dit wordt gevolgd door instillatie van het muizen blaaskanker cellijn (1 x 10 5 cellen / 50 ul) met een snelheid van 10 pl / 20 s. De katheter wordt afgesloten om voortijdige afvoer voorkomen. Na 1 uur worden de muizen herleven een ommekeer geneesmiddel en de blaas wordt ontruimd. De langzame indruppeling snelheid is belangrijk,aangezien er minder vesico-ureterale reflux, wat kan leiden tot tumoren kunnen optreden in het bovenste urinewegen en de nieren. De cellijn moet goed worden geresuspendeerd tot samenklontering van cellen te verminderen, aangezien dit kan leiden tot ongelijke tumorgrootten na implantatie.
Deze techniek veroorzaakt tumoren met hoog rendement. De tumorgroei wordt gevolgd door PSA urinaire uitscheiding. PSA marker monitoring betrouwbaarder dan echografie of fluorescentie ter detectie van de aanwezigheid van tumoren in de blaas. Tumoren bij muizen in het algemeen te bereiken van een maximale grootte die een negatieve invloed op de gezondheid van ongeveer 3-4 weken indien onbehandeld. Door het monitoren tumorgroei, is het mogelijk om muizen die waren genezen van degenen die niet succesvol werden geïmplanteerd met tumoren onderscheiden. Met slechts eindpunt analyse, kan deze ten onrechte worden geacht te zijn genezen door therapie.
Het doel van deze methode is het murine orthotope blaastumoren genereren en de geïmplanteerde tumoren zo goed mogelijk te bewaken, zodat muizen zonder tumor implantatie niet worden verondersteld te zijn gehard bij eindpunt analyse. Kortom, de methode getoond wordt de behoefte aan grote aantallen muizenmaagjes experimentele analyse verlagen en een grotere nauwkeurigheid bij het bepalen van therapeutische resultaten.
De ontwikkeling van een orthotopic model voor kanker is belangrijk omdat het implanteren van tumorcellen subcutaan niet het milieu van de klinische ziekte recapituleren of schakelen de ontwikkeling van therapeutische strategieën. De architectuur van de blaas maakt de instillatie van blaaskanker behandelingen direct in de blaas met minimale systemische effecten. Aldus diermodellen dat deze omgeving recapituleren, zoals een orthotope model, zijn belangrijk om nieuwe therapieën te evalueren. De conclusies van een experimentele opstelling worden dependent op de beperkingen van het model.
Verscheidene technieken zijn ontwikkeld voor de productie van orthotope blaas tumoren in muizen. Deze steunen op beschadiging van de glycosaminoglycan laag van de blaas, waardoor tumorcellen te implanteren. De toegepaste technieken zijn elektrocauterisatie waardoor één schadepunt in de blaaswand, waardoor tumorontwikkeling op een locatie in de blaas 1,2. Echter, het succes van tumor implantatie gebruik elektrocauterisatie operator afhankelijk variërend van 10 – 90%, en bevat het gevaar dat de blaaswand wordt doorboord, waardoor tumoren ontwikkelen in de peritoneale holte. Chemische brandijzer wordt uitgevoerd met behulp van zilvernitraat, die schade toebrengt aan de blaaswand 3. Evenzo is zuur gebruikt om de blaaswand 4 beschadigen. Trypsine is ook gebruikt om de blaas en 5 beschadigen. Deze werkwijzen kunnen leiden tot de ontwikkeling van meer dan één tumor in de blaas.Verder bestaat het gevaar voor vernieling van de blaas of de chemicaliën in contact gelaten met de blaaswand te lang. De werkwijze ontwikkeld door Ninalga et al. wordt de positief geladen poly-L-lysine (PLL) 6 moleculen het bekleden van de blaaswand; Dit maakt de negatief geladen tumorcellen te houden aan het glycosaminoglycan laag van de blaas. Deze werkwijze resulteert in het algemeen in meer dan één tumor ontwikkeling in de blaas, maar tumor implantatie bij 80-100% 4,7. Technisch is bovendien zeer eenvoudig uit te voeren procedure. Opdat de tumoren die ontstaan zijn vrij gelijkmatige grootte, is het belangrijk dat de tumorcellen niet worden gegroepeerd in grote pollen voor implantatie.
Om therapeutische effectiviteit te evalueren, is het het beste om dit onderzoek bij muizen met relatief dezelfde grootte tumoren. Dus een goede detectiesysteem dat tumorgrootte snel kunnen kwantificeren na implantatie is belangrijk. Verschillende strategieën been gebruikt om tumoren te evalueren. Deze omvatten magnetische resonantie imaging (MRI) 8-10, 11 fluorescentie, bioluminescentie 12,13, ultrageluid 14 en enzymgekoppelde immunosorbent assay (ELISA) 15,16. Terwijl MRI en echografie geen modificaties van de tumorcellen vereist, is er behoefte aan gevoelige apparatuur en contrastmiddelen voor MRI. De fluorescentie-, luminescence- en ELISA-gebaseerde testen vereisen aanpassing van de tumorcellen merker eiwitten die door deze werkwijzen kan worden gedetecteerd uitdrukken. Voor luminescentie, is een substraat nodig voor de detectie van de luciferaseactiviteit; Er is dus een extra stap en hogere kosten. Zowel luminescentie en fluorescentie vereisen gespecialiseerde apparatuur. Fluorescentie produceert, groen fluorescerend eiwit (GFP) cyclisatie, die wordt gekatalyseerd door moleculaire zuurstof is vereist. Zo kan GFP expressie variabele binnen een tumor massa, afhankelijk van de toegang tot zuurstof, waardoor dit een nogal onbetrouwbaar marker <sup> 17. Modificatie van het muizen blaaskanker cellijn MB49 mens prostaatspecifiek antigeen (PSA) 15,16 scheiden als een surrogaat marker andere strategie. Deze markers ook een alternatieve manier bevestigt aanwezigheid tumor bij de beëindiging van het experiment, waardoor ze een alternatief voor immunohistochemie. Deze studie toont de PLL werkwijze orthotope tumor implantatie en wordt een vergelijking van tumor detectiesystemen, namelijk ELISA, fluorescentie en echografie.
De meest kritische stappen in het protocol zijn: 1) met succes het behoud van de tumorigeniciteit van de cellijn; 2) zorgen voor meetbare PSA uitscheiding voordat tumorcel implantatie bij muizen; 3) het genereren van een eencellige suspensie voor implantatie om variatie in tumorgrootte verminderen; en 4) het indruppelen cellen met een lage snelheid om vesico-ureterale reflux te voorkomen, waardoor tumorcel implantatie in de nier.
Na langdurig passage in vitro, kan MB49 / MB49-PSA ce…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.
MB49-PSA cells | N/A | N/A | ref (Wu QH, 2004) |
RPMI 1640 media | HyClone | SH30027.01 | |
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) media | Biowest | L0102 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American | Biowest | S1810 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, Premium | Biowest | S181B | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30088.03 | |
L-glutamine | Biowest | X0550 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022 | |
Hygromycin B | Invitrogen | 10687-010 | |
free PSA (Human) ELISA kit | Abnova | KA0209 | |
TRIzol Reagent for RNA extraction | Ambion | 15596026 | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Applied Biosystems | 4374967 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse Actb | Applied Biosystems | 4331182 | Mm00607939_s1 |
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3 | Applied Biosystems | 4331182 | Hs00426859_g1 |
C57BL/6J female mice | In Vivos | 4-6 wk old | |
Anesthesia (75mg/kg Ketamine and 1mg/kg Medetomidine) | Local pharmacy | ||
Reversal drug (1mg/kg Atipamezole) | Local pharmacy | ||
Ear punch | Electron Microscopy Sciences | 72893-01 | |
Hartmann's solution or Compound sodium lactate | B Braun | ||
Ophthalmic ointment – Duratears sterile ocular lubricant ointment | Alcon | ||
Heat pack – HotHands handwarmers | Heatmax Inc | ||
Introcan Certo IV catheter | B Braun | 4251300 | 24G x 3/4″ |
Aquagel Lubricating jelly | Local pharmacy | ||
Poly-L-lysine solution, 0.01%, | Sigma | P4707 | |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693159001 | |
Quantichrom Creatinine Assay Kit | BioAssay Systems | DICT-50 | |
Fluorescent dye – VivoTrack 680 | Perkin Elmer | NEV12000 | |
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition Solution | Ambion | 4427575 | |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Equipment and Software | |||
7500 Realtime PCR System | Applied Biosystems | ||
7500 Software v2.3 | Applied Biosystems | ||
Metabolic Cage | Tecniplast | Vertical type rack for 12 cages | |
BD FACSCanto I system | BD Biosciences | ||
BD FACSDiva software v7 | BD Biosciences | ||
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system | Caliper Life Sciences | ||
Living Image Software v3.1 | Caliper Life Sciences | ||
Vevo 2100 imaging system | VisualSonics |