This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy. The setup is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel and letting it grow in controlled bright conditions. This allows long-term observation of plant organ development in standardized conditions.
One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the observation of the whole organ with a high spatial- as well as temporal resolution over prolonged periods of time, which may cause photo-toxic effects. This protocol shows a plant sample preparation method for light-sheet microscopy, which is characterized by mounting the plant vertically on the surface of a gel. The plant is mounted in such a way that the roots are submerged in a liquid medium while the leaves remain in the air. In order to ensure photosynthetic activity of the plant, a custom-made lighting system illuminates the leaves. To keep the roots in darkness the water surface is covered with sheets of black plastic foil. This method allows long-term imaging of plant organ development in standardized conditions.
Een van de belangrijkste vragen in het begrijpen van de ontwikkeling van planten is hoe enkele cellen gedragen tijdens orgel differentiatie en groei. Idealiter cellulaire gebeurtenissen, zoals genexpressie patronen en intracellulair eiwit lokalisatie, kunnen worden gezien in het licht van een grotere context van het weefsel. Deze doelstelling vormt technische uitdagingen en vereist een hele orgel observatie met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie gedurende langere perioden, welke foto-toxiciteit effecten veroorzaken. Aangezien planten zich snel aanpassen aan veranderingen in het milieu, moet de groeiomstandigheden strak worden gecontroleerd. Om langdurige imaging zonder te interfereren met de fysiologische toestand van de installatie zijn drie dingen worden gezorgd, 1) groeiomstandigheden in de monsterkamer, 2) stabiel sample bevestiging gedurende lange tijd, en 3) de beeldvorming met lage lichtintensiteiten om foto-schade en niet-fysiologische omstandigheden te voorkomen.
Fysiologische groeiende conditions in de microscoop monster kamer zijn van cruciaal belang voor de lange termijn experimenten. Er zijn een aantal protocollen voor beeldvorming die groeikamers beschrijven confocale microscopen 1-3. Echter, confocale microscopie introduceert hoge lichtintensiteit aan de plant, die stressreacties kunnen veroorzaken en meestal remt de groei 4. Bovendien zijn de meeste conventionele microscopen staan alleen horizontale positionering van het monster, die niet optimaal is voor planten, aangezien zij proberen zich te heroriënteren en groeien naar de vector van de zwaartekracht. In de afgelopen tien jaar heeft het licht-sheet microscopie ontpopt als een krachtig instrument om de ontwikkeling van de grote exemplaren op cellulair resolutie vast te leggen voor perioden van maximaal enkele dagen 5-9. Light-sheet microscopie maakt het positioneren van het monster verticaal en wordt steeds meer gebruikt bij plantenonderzoek bestuderen wortel ontwikkeling 10-21, onlangs beoordeeld door Berthet en Maizel 22. Veel van de genoemde studies 10,13 – 18,21 geoptimaliseerd en uitgevoerd in het laboratorium van Ernst HK Stelzer waarbij een bijzondere manier monster montage gekenmerkt door toenemende de wortel op het oppervlak van een gel 17. In deze studies werd een op maat gemaakte microscoop gebruikt, waarbij de plant wordt gehouden van de bodem. In tegenstelling tot de meeste algemeen beschikbare licht-sheet microscopen houdt het monster uit de top. Aldus is deze bijzondere bereidingswijze kan niet gemakkelijk worden toegepast. De hier gepresenteerde methode biedt een protocol voor de gevestigde on-opbouw methode geldt voor de OpenSPIM 23, een open access platform voor de toepassing en de verbetering van Selectieve Plane Verlichting Microscopy (SPIM).
De algemene doelstelling van dit protocol is om op lange termijn beeldvorming van Arabidopsis wortels in te schakelen in de OpenSPIM licht-sheet microscoop. Dit wordt bereikt door een plant te kweken rechtop op de surface van een gel met de wortels in een vloeibaar medium terwijl de bladeren in de lucht blijven. Om fotosynthetische activiteit van de plant te verzekeren, een op maat gemaakte verlichting verlicht de bladeren maar niet de wortels (figuur 1).
Sheet licht fluorescentiemicroscopie heeft het grote voordeel lage fototoxiciteit en ultrasnelle acquisitiesnelheid, die kan worden gebruikt om een groot volume vastleggen met een hoge ruimtelijke resolutie terwijl het monster in een fysiologische toestand combineren. De resolutie van een lichte plaat microscoop is te vergelijken met die van een confocale microscoop 9. Echter, lichtverstrooiing en absorptie optreedt langs de excitatie en emissie pad individueel en de algehele beeldkwaliteit aanzienlijk lager in ondoorzichtig weefsel ten opzichte van het oppervlak. Om deze complicatie te omzeilen kan men de mogelijkheid om het monster langs de verticale as roteren en hetzelfde volume vanuit verschillende richtingen te observeren. Maar dit is niet altijd voordelig, bijv zijwortels komen aan één zijde van de wortel en imaging achter resulteert in een lage beeldkwaliteit zonder het verkrijgen van meer informatie. Echter, de rotatie in hoofdzaak gebruikt voor het positioneren sample op de beste manier. De klassieke horizontale opstelling van de objectieven maakt nieuwe manieren sample montage. Planten profiteren van een verticale positie. Hier voorgesteld, de "aan het oppervlak van de gel" montagemethode heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere bevestigingsmethoden, zoals inbedden van de wortel in een gel 24,25. 1) Het wortelsysteem staat in direct contact met het vloeibare medium. De monsterkamer is verbonden met een perfusie systeem dat continu vers medium bepaalt. Het kan ook worden gebruikt om het gehele volume van de monsterkamer snel wisselen verschillende media of middelen toepassen. 2) Voor bereiding van het monster planten groeien als ze worden gebruikt om te groeien in laboratoria. Planten kunnen worden geselecteerd onder een fluorescentiemicroscoop en alleen de gewenste planten moeten worden voorbereid. 3) De plant wordt overgebracht van de petrischaal op de monsterhouder zonder aangeraakt. Waardoor de plant zich verder kan ontwikkelen op dezelfde gel werd groeien op de groei incubator en mechanische spanning wordt geminimaliseerd. 4) Het uitzicht op het monster is vrij en optische aberraties worden geminimaliseerd, omdat de ruimte tussen het monster en de detectie doel uitsluitend is gevuld met medium en geen andere materialen met verschillende brekingsindex.
Om langdurige beeldvorming uitvoeren, de plant belichtingssysteem moet fotosynthetische activiteit van de plant te waarborgen. In de meeste laboratoria planten groeien op een transparante gel, dat wil zeggen de wortels worden blootgesteld aan licht. Dit kan verschillende reacties op hun omgeving veroorzaken en leidt tot veranderingen in hun biochemie en ontwikkeling 26,27. Om de hoeveelheid licht op het wortelsysteem verlagen, zwarte kunststof folie gebruikt om het wateroppervlak en een deksel in zwart aluminiumfolie onder de monsterkamer dekken. Licht kan de plant te bereiken verlaat door de centrale opening in het deksel. In deze opstelling, werd geen toename in de achtergrond licht waargenomen, suggesting dat de hoeveelheid verstrooid licht van de rode en blauwe LED's aanzienlijk werd gereduceerd door het GFP-filter en de schaduw benaderingen. Hierdoor kon het licht ingeschakeld tijdens beeldacquisitie houden zonder dat de camera achtergrondgeluid.
De monsterhouder is ontworpen om 3D-printen. De materiaalkeuze is belangrijk, omdat verschillende kunststoffen die werden getest niet 100% stabiel waren, wat resulteert in een afwijking van het monster. Daarom is het raadzaam om harsen te gebruiken in plaats of bouwen van de monsterhouder door het frezen van een Polyethyleen (PEP) staaf. Bij gebruik van een lichte plaat microscoop opstelling met dubbelzijdig belichtingsstelsel de monsterhouder kan storen van het licht vellen afhankelijk van de rotatiehoek. Mechanische stress tijdens het uithollen van de plant uit de plaat te verminderen, gebruik dan een vlakke hoek van de spatel. De plant kan snel uitdrogen en ervaring luchtstroom voor de allereerste keer. Probeer aan een doorvaarthoogte (snelle bewegingen, airconditioning flow) te voorkomen, work ononderbroken en schuif de monsterhouder in een 1000 pi pipet tip waar mogelijk. Binnen de microscoop, is het cruciaal om niet dompel de hele plant in vloeibare en houdt de bladeren droog.
De techniek is ideaal voor de beeldvorming vroege stadia van laterale wortelvorming. Bij het uitvoeren van de lange termijn beeldvorming van oudere wortel tips moet men in gedachten houden dat Arabidopsis wortels groeien met 100-300 um / h snel uit het gezichtsveld. Een zeer nuttige toekomstige uitvoering kan een geautomatiseerd tracking-algoritme, dat volgende wortel tip groei zou toelaten gedurende langere perioden van tijd. Het vermogen om omgevingsfactoren zoals licht en voedingsstoffen samenstelling van het medium regelen tijdens het acquisitieproces laat onderzoeken hoe planten zich aanpassen aan veranderingen. De wortel is in direct contact met het vloeibare medium, dat kan worden gebruikt om geneesmiddelen van toepassing op chemisch activeren genexpressie, bijvoorbeeld met de dexamethason induceerbare 28 of β-estradiol induceerbaar systeem 29. Echter, het kost tijd om het gehele volume van de monsterkamer wisselen spoelen een geneesmiddel. De installatie kan worden verbeterd door het minimaliseren van het volume van de monsterkamer tot medium uitwisseling versnellen. Toch is deze techniek heeft een groot potentieel. De combinatie van de montage procedure, gestandaardiseerde groeiomstandigheden en de zachte imago acquisitie met behulp van licht-sheet microscopie maakt het mogelijk op lange termijn studies van de ontwikkeling van de plant met een hoge resolutie op een fysiologisch niveau. Dit zal onderzoekers helpen om de fundamentele mechanismen van de ontwikkeling van de plant te verkennen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Matyáš Fendrych voor kritisch lezen / bekijken en Stephan Stadlbauer voor de audio-apparatuur. Dankzij de Miba Machine Shop bij IST Oostenrijk voor hun bijdrage aan de OpenSPIM. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van het programma Mensen (Marie Curie-acties) van het Zevende Kaderprogramma van de Europese Unie (FP7 / 2007-2013) onder REA subsidieovereenkomst n ° [291734] en de European Research Council (ERC-project 2011 -StG-20101109-PSDP).
Agarose, low melting | VWR | AFFY3282125GM | |
Black aluminum foil | Thorlabs | BKF12 | |
Black plastic foil | Carl Roth | HT83.2 | |
LED blue (453 nm) | OSRAM | LD CN5M-1R1S-35-1 | |
LED red (625 nm) | OSRAM | LR T66F-ABBB-1-1 | |
LED board – PCB design software | Cadsoft Eagle | ||
MES monohydrate | Duchefa | M1503.0100 | |
Micropore Surgical Tape | 3M | 1530-1 | |
Murashige & Skoog Medium (MS-Medium) | Duchefa | M0221 | |
Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
Sample holder 3D print | i.materialise | https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1 | |
Square petri dishes (245x245x25 mm) | VWR | 734-2179 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097-1KG |