Summary

Vasodilatazione dei vasi isolati e l'isolamento della matrice extracellulare di topi Tight-pelle

Published: March 24, 2017
doi:

Summary

We describe the isolation of cardiac extracellular matrix from C57Bl/6J control mice, tight-skin mice, and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide. We also describe the vasodilation studies on the isolated vessels from C57Bl/6J, tight-skin mice and tight-skin mice treated with the IRF5 inhibitory peptide.

Abstract

The interferon regulatory factor 5 (IRF5) is crucial for cells to determine if they respond in a pro-inflammatory or anti-inflammatory fashion. IRF5’s ability to switch cells from one pathway to another is highly attractive as a therapeutic target. We designed a decoy peptide IRF5D with a molecular modeling software for designing small molecules and peptides.

IRF5D inhibited IRF5, reduced alterations in extracellular matrix, and improved endothelial vasodilation in the tight-skin mouse (Tsk/+). The Kd of IRF5D for recombinant IRF5 is 3.72 ± 0.74 x 10-6 M as determined by binding experiments using biolayer interferometry experiments. Endothelial cells (EC) proliferation and apoptosis were unchanged using increasing concentrations of IRF5D (0 to 100 µg/mL, 24 h). Tsk/+ mice were treated with IRF5D (1 mg/kg/d subcutaneously, 21 d). IRF5 and ICAM expressions were decreased after IRF5D treatment. Endothelial function was improved as assessed by vasodilation of facialis arteries from Tsk/+ mice treated with IRF5D compared to Tsk/+ mice without IRF5D treatment. As a transcription factor, IRF5 traffics from the cytosol to the nucleus. Translocation was assessed by immunohistochemistry on cardiac myocytes cultured on the different cardiac extracellular matrices. IRF5D treatment of the Tsk/+ mouse resulted in a reduced number of IRF5 positive nuclei in comparison to the animals without IRF5D treatment (50 µg/mL, 24 h). These findings demonstrate the important role that IRF5 plays in inflammation and fibrosis in Tsk/+ mice.

Introduction

Regolazione della crescita cellulare e la morte cellulare risposte immunitarie è fondamentale per il ruolo del fattore di trascrizione famiglia di fattori regolatori interferone. IRF5 è evidenziato come cruciale per la regolazione delle risposte immunitarie tra il tipo 1, una risposta infiammatoria promuovendo e di tipo 2, una riparazione dei tessuti risposta immunitaria targeting. IRF5 è fondamentale nel cancro 1, e l'autoimmunità 2, 3, 4, 5.

Il mouse tight-pelle (Tsk / +) è un modello per la fibrosi dei tessuti e la sclerodermia a causa di una mutazione duplicazione nel fibrillin-1 gene. Questa mutazione si traduce in una stretta-pelle e un aumento del tessuto connettivo. Questi topi sviluppano infiammazione del miocardio, fibrosi e infine insufficienza cardiaca 5, 6, 7,> 8, 9. La sclerodermia è una malattia fibrotica autoimmune che colpisce circa 150.000 pazienti negli Stati Uniti 6. Le caratteristiche di questa malattia sono la fibrosi degli organi interni compreso il cuore 7, 8, 9, 10, 11.

La natura dello studio richiedeva la progettazione di un peptide inibitorio. L'approccio software è stato scelto per un approccio tradizionale utilizzando un phage display. L'approccio è il più semplice e meno che richiede tempo. La banca dati RCSB viene utilizzato per identificare opportuni siti di legame 12. Per studiare l'interazione del peptide di nuova concezione con la proteina ricombinante e di concentrarsi sui parametri di legame, è stata utilizzata una tecnica chiamata interferometria biolayer. Biolayer interferometria è un biosensore basato technique che determina affinità di legame, di associazione e dissociazione utilizzando un biosensore e un campione vincolante. Il biosensore può essere fluorescente, luminescently, radiometricamente e colorimetricamente etichettato. La misura si basa sulla aggiunta di massa o l'esaurimento simile associazione e dissociazione 13, 14. Lo scopo di questo studio è stato quello di comprendere il ruolo di IRF5 in infiammazione del miocardio e fibrosi. L'obiettivo era quello di ottenere una conoscenza approfondita del ruolo della IRF5 nello sviluppo della fibrosi dei tessuti e la sclerodermia.

Protocol

Questo studio è stato condotto in stretta conformità con le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa (Protocollo: AUA # 1517). Tutte le ricerche che coinvolgono i topi è stata condotta in conformità con la politica PHS. 1. Progettazione di Decoy Peptide Trova struttura 3D della IRF5 e basare il disegno su di esso. Progettare un…

Representative Results

I risultati hanno dimostrato nella figura 1 mostrano come progettare un peptide. Figura 1, in alto a sinistra, mostra la regione (tra le 2 frecce gialle, aminoacidi (aa) 425-436) in IRF5 che viene fosforilato da un certo numero di chinasi. Figura 1, in alto a destra, mostra una forma ovale di colore giallo dove dominio fosforilata di IRF5 lega. La struttura dimerica del 3DSH è stato ruotato di osservare una fessura o valle a fianco dell…

Discussion

L'obiettivo era quello di progettare un inibitore IRF5 per chiarire il ruolo di IRF5 sulla infiammazione, la fibrosi e la funzione vascolare nei cuori di Tsk / + topi. I risultati sono che IRF5D non ha indotto la proliferazione o l'apoptosi. Inoltre, l'infiammazione si è ridotta e la funzione vascolare migliorata. Questi dati suggeriscono che IRF5 svolge un importante ruolo meccanicistica nello sviluppo di infiammazione e fibrosi nel cuore di Tsk / + topi e che ha il potenziale per servire come un obiettivo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by NIH grants HL-089779 (DW), HL-112270 (KAP) and HL-102836 (KAP) and Cimphoni Life Sciences (part of DW salary). The authors thank Meghann Sytsma for editing the manuscript.

Materials

 Triton X 100 Sigma Aldrich X100- 100ml
Alexa 488-labeled goat anti-mouse IgG antibody  Thermo Fisher A11001
Bardford reagent Thermo Fisher 23200 Pierce 
Biosensors Forte-Bio MR18-0009
CD64 (H-250) Santa Cruz Biotechnologies sc-15364
CellEvent Caspase-3/7 Substrate Thermo Fisher/Life Technologies C10427
CellTiter AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kit Promega G3580 Promega
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) Thermo Fisher D-1306 1:1000 dilution in PBS
donkey anti rat Alexa 488 Thermo Fisher A-21208 1:1000 dilution in PBS
ECL plus GE healthcare/Amersham RPN2133 After a lot of trial and error we came back to this one
Eclipse TE 200-U microscope with EZ C1 laser scanning software Nikon
goat anti rabbit Alexa 488 Thermo Fisher A-11008 1:1000 dilution in PBS
HRP  anti-goat Santa Cruz Biotechnologies sc-516086 !:10000 dilution in TBS
HRP donkey anti-mouse Santa Cruz Biotechnologies sc-2315 1:10000 dilution in TBS
ICAM-1 antibody Santa Cruz Biotechnologies sc-1511 1:200 dilution in PBS
IRF5 antibody (H56) Santa Cruz Biotechnologies sc-98651
Micro plate reader Elx800 Biotek
NIMP neutrophil marker Santa Cruz Biotechnologies sc-133821 1:200 dilution in PBS
Octet RED Forte Bio protein-protein binding
Peptide design  Medit SA software RCSB.org
Recombinant IRF5 protein synthesis TopGene Technologies protein expression, synthesis service
sodium dodecyl phosphate Sigma Aldrich 436143 detergent
Ketamine Pharmacy Schedule III controlled substance, presciption required 
Xylazine MedVet
3.5X-45X Trinocular Dissecting Zoom Stereo Microscope with Gooseneck LED Lights Am Scope SKU: SM-1TSX-L6W
Zeba Desalting Columns Thermofisher 2161515
Endothelial Basal Media EBM Bullet kit Lonza CC-3124 kit contains growth supplemets
VIA-100K  Boeckeler Instruments
4-15% TGX gel Bio-Rad 5671081
MedSuMo software Medit, Palaiseau, France
Laemmli Buffer BioRad

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Cite This Article
Weihrauch, D., Krolikowski, J. G., Jones, D. W., Zaman, T., Bamkole, O., Struve, J., Pagel, P. S., Lohr, N. L., Pritchard, Jr., K. A. Vasodilation of Isolated Vessels and the Isolation of the Extracellular Matrix of Tight-skin Mice. J. Vis. Exp. (121), e55036, doi:10.3791/55036 (2017).

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