Summary

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti<em> Clostridium difficile</em> R20291 Strain

Published: December 10, 2016
doi:

Summary

Questo protocollo delinea il modello di topo cefoperazone di infezione da Clostridium difficile (CDI) con un ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. L'enfasi sul monitoraggio clinico della malattia, C. enumerazione batterica difficile, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici tutto CDI in un modello di topo sono dettagliati nel protocollo.

Abstract

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Introduction

Clostridium difficile è un anaerobica,, bacillo spore gram-positivi che causa pericolo di vita la diarrea 1. Infezione da C. difficile (CDI) è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità umana e si traduce in più di 4,8 miliardi di $ in spese sanitarie per anno 1-4. Nel 2013, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie classificati C. difficile come un rischio resistenza agli antibiotici urgente, indicando che essa pone una minaccia urgente per la salute pubblica 1. Attualmente, il trattamento antibiotico con vancomicina e metronidazolo sono considerati lo standard di cura per CDI 5. Purtroppo, il ripetersi di CDI dopo il successo del trattamento con antibiotici è alto, che si verificano nel 20 – 30% dei pazienti 2,5-7. Pertanto, la scoperta di nuove terapie contro questo patogeno enterico è necessario. Per valutare terapie contro il C. difficile, un modello animale approssimare la malattia umana in acè necessario un ceppo linically rilevanti.

Inizialmente, i postulati di Koch sono stati stabiliti per il C. difficile nel 1977 utilizzando un modello di criceto siriano clindamicina trattati con 8. Questo modello è ancora utilizzato oggi per studiare gli effetti delle tossine di C. difficile sulla patogenesi 9,10. Tuttavia, CDI nel modello criceto si traduce in alti tassi di mortalità e non, sul ravvicinamento delle manifestazioni della malattia insidiosi croniche che possono essere visti in esseri umani con CDI 10,11. Sulla base della accessibilità e la disponibilità di piattaforme reagente murini in ricerca, un modello murino di CDI è rilevante.

Nel 2008, un modello di topo robusto CDI è stato istituito con il trattamento di topi con un cocktail di antibiotici nell'acqua potabile (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazolo e vancomicina) per 3 giorni, seguiti da un'iniezione intraperitoneale di clindamicina 12. Questo topi resi sensibili alla colite CDI e grave. Dipenderezione della dose somministrata inoculo, una serie di segni clinici e letalità può osservare utilizzando questo modello. Da quel momento, i vari regimi antibiotici sono stati studiati che alterano la flora intestinale murino, diminuendo la resistenza colonizzazione al punto in cui C. difficile può colonizzare il tratto gastrointestinale (rivisto nel miglior et al. E Lawley & Young) 13,14.

Più di recente, un ampio spettro di cefalosporina, cefoperazone, data in acqua potabile per 5 o 10 giorni rende riproducibile topi suscettibili di CDI 15. Dal momento che la somministrazione di cefalosporine di terza generazione sono associati ad un aumentato rischio di CDI negli esseri umani, l'uso del modello cefoperazone riflette in modo più accurato la malattia 16 in natura. Cefoperazone trattati topi suscettibili di C. difficile è stato messo in discussione con entrambe le spore di C. difficile e le cellule vegetativa di una varietà di ceppi che vanno a clinicarilevanza e virulenza 17. Nonostante alcuni degli studi originali che utilizzano C. cellule vegetative difficile del come la forma infettiva, spore di C. difficile del sono considerati la principale modalità di trasmissione 18.

Negli ultimi dieci anni, C. difficile R20291, un NAP1 / BI / 027 ceppo, è emerso, causando epidemie di CDI 19,20. Abbiamo cercato di determinare il decorso clinico della malattia, quando i topi Cefoperazone trattati si sono sfidati con il C. difficile ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. Dettagli Questo protocollo il decorso clinico, tra cui la perdita di peso, la colonizzazione batterica, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici nel tratto gastrointestinale dei topi sfidati con spore di C. difficile R20291. Nel complesso, questo modello di topo si rivela essere una piattaforma sperimentale prezioso per CDI approssimare malattie umane. Questo modello caratterizzato mouse può quindi essere utilizzato per valutare gli effettidi nuove terapie per il miglioramento della malattia clinica e sul restauro della resistenza colonizzazione contro C. difficile.

Protocol

Dichiarazione etica: La cura degli animali e Usa Comitato Istituzionale (IACUC) alla North Carolina State University College di Medicina Veterinaria (NCSU) ha approvato questo studio. La cura NCSU animali e utilizzare la politica applica gli standard e le linee guida stabilite nel benessere degli animali Act e di estensione Health Research Act del 1985. Laboratorio strutture animali a NCSU aderire alle linee guida indicate nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Gli stati di salute deg…

Representative Results

Durante uno studio rappresentativo, 5 settimane di età C57BL / 6 topi WT sono stati pretrattati con cefoperazone nella loro acqua potabile (0,5 mg / ml) per 5 giorni e ha permesso a 2 giorni lavare con acqua potabile normale. I topi sono stati sfidati con 10 5 spore di C. difficile R20291 tramite sonda gastrica al giorno 0 (Figura 1A). I topi sono stati monitorati per la perdita di peso e segni clinici (letargia, inappetenza, diarrea, e la postura in…

Discussion

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Trevor Lawley at the Wellcome Trust Sanger Institute for C. difficile R20291 spores and James S. Guy at the North Carolina State University College of Veterinary Medicine for Vero cells, both utilized in this manuscript. Animal histopathology was performed in the LCCC Animal Histopathology Core Facility at the University of North Carolina at Chapel Hill, with special assistance from Traci Raley and Amanda Brown. The LCCC Animal Histopathology Core is supported in part by an NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) to the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We would also like to thank Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie, and Cassie Schumacher for helpful discussions on the Vero cell cytotoxicity assay protocol. JAW is funded by the Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 by NIH. CMT is funded by the career development award in metabolomics grant K01GM109236 by the NIGMS of the NIH.

Materials

#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner  SSS Navigator 48027 This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter Fisherbrand 09-720-3 Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200-056 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
0.4% Trypan Blue Gibco 15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin Gibco 15070-063
10% heat inactivated FBS Gibco 16140-071 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
1ml plastic syringe  BD Medical Supplies 309628
1X PBS Gibco 10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap Corning 430917
96 well cell culture flat bottom plate Costar Corning CL3595
96 well filter plate Millipore MSGVS2210
Adhesive Seal ThermoScientific AB-0558
Bacto Agar Becton Dickinson 214010 Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone Becton Dickinson 211684 Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone MP Bioworks 199695
Cefoxitine Sigma C47856 Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit Tech Labs T5000 Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A List Biological Labs 152C Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine Sigma C6880 Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water Gibco 15230
DMEM 1X Media Gibco 11965-092 Needs to be heated in water bath at 37C prior to use
Fructose Fisher L95500 Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer Bright-Line, Sigma Z359629
KH2PO4 Fisher P285-500 Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous) Sigma M2643 Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter Millex-GS SLGS033SS Filter for TCCFA plates 
Na2HPO4 Sigma S-0876 Part of TCCFA plates (see below)
NaCl Fisher S640-3 Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade Miltex, Inc 4-410
PCR Plates Fisherbrand 14230244
Plastic petri dish Kord-Valmark Brand 2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader Fisherbrand 14-665-230
Syringe Stepper Dymax Corporation T15469
Taurocholate Sigma T4009 Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water Invitrogen 10977-015
C57BL/6J Mice The Jackson Laboratory 664 Mice should be 5-8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope Olympus Life Science
DP27 camera Olympus Life Science
cellSens Dimension software  Olympus Life Science

References

  1. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
  2. Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
  3. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, 88-92 (2012).
  4. Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  5. Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile–more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
  6. Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
  7. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
  8. Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
  9. Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
  10. Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
  11. Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
  12. Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
  13. Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
  14. Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
  15. Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, 19-31 (2008).
  16. Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
  17. Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
  18. Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
  19. He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
  20. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
  21. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , (2009).
  22. Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
  23. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
  24. Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S., Dintzis, S. M. . Comparative Anatomy and Histology. , 15-40 (2012).
  25. Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , (2008).
  26. Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
  27. Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
  28. Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
  29. Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
  30. Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
  31. Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
  32. Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).

Play Video

Cite This Article
Winston, J. A., Thanissery, R., Montgomery, S. A., Theriot, C. M. Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291. J. Vis. Exp. (118), e54850, doi:10.3791/54850 (2016).

View Video