Summary

High Throughput, en temps réel, à double lecture Test de intracellulaires activité antimicrobienne et eucaryotes cytotoxicité cellulaire

Published: November 16, 2016
doi:

Summary

A high throughput, real-time assay was developed to simultaneously identify (1) eukaryotic cell-penetrant antimicrobials targeting an intracellular bacterial pathogen, and (2) assess eukaryotic cell cytotoxicity. A variation on the same technology was thereafter combined with digital dispensing technology to enable facile, high-resolution, dose-response, and two- and three-dimensional synergy studies.

Abstract

Les mesures traditionnelles d'activité antimicrobienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules eucaryotes reposent sur des tests finaux. De tels tests finaux nécessitent plusieurs étapes expérimentales supplémentaires avant une lecture, telles que la lyse cellulaire, la formation de colonies de détermination de l'unité, ou l'addition de réactifs. Lorsque vous effectuez des milliers de tests, par exemple, au cours de criblage à haut-débit, l'effort aval requis pour ces types d'essais est considérable. Par conséquent, pour faciliter la découverte antimicrobienne à haut débit, nous avons développé un essai en temps réel pour identifier simultanément des inhibiteurs de la croissance bactérienne intracellulaire et d'évaluer la cytotoxicité des cellules eucaryotes. Plus précisément, la détection de la croissance bactérienne intracellulaire en temps réel a été activé par le marquage des souches bactériennes de criblage soit d' un opéron bactérien lux (1 essai de génération st) ou reporters de protéines fluorescentes (2 ème génération, le dosage orthogonales). Une membrane cellulaire imperméant, un colorant de liaison aux acides non toxiques, Nucleica également été ajouté au cours de l'infection initiale des macrophages. Ces colorants sont exclues des cellules viables. Cependant, les cellules hôtes non viables perdent l'intégrité de la membrane permettant l'entrée et le marquage fluorescent de l'ADN nucléaire (acide désoxyribonucléique). Notamment, la liaison d'ADN est associée à une forte augmentation du rendement quantique de fluorescence qui fournit une lecture à base de solution de la mort de la cellule hôte. Nous avons utilisé ce dosage combiné pour réaliser un écran à haut rendement en format microplaque, et pour évaluer la croissance intracellulaire et la cytotoxicité par microscopie. En particulier, les antimicrobiens peuvent présenter une synergie dans laquelle l'effet combiné de deux ou plusieurs agents antimicrobiens, lorsqu'il est appliqué en même temps est supérieur lorsqu'ils sont appliqués séparément. Test de synergie in vitro contre les pathogènes intracellulaires est normalement une tâche prodigieuse permutations combinatoires d'antibiotiques à différentes concentrations doivent être évaluées. Cependant, nous avons trouvé que notre analyse en temps réel combinée avec automatisé, distribution numérique technologie permitted tests de synergie facile. L' utilisation de ces approches, nous avons pu étudier systématiquement l' action d'un grand nombre des seuls antimicrobiens et en combinaison contre le pathogène intracellulaire, Legionella pneumophila.

Introduction

Pathogens qui poussent ou résident temporairement dans des compartiments intracellulaires sont difficiles à éradiquer thérapeutique. OBLIGER ou relativement obliger les agents pathogènes intracellulaires tels que Legionella pneumophila, Coxiella burnetii, Brucella spp. , Francisella tularensis, et Mycobacterium spp. nécessitent souvent des cours de thérapie antimicrobienne prolongée pour la guérison qui peut aller de quelques mois à voire des années. En outre, les agents pathogènes extracellulaires peuvent transitoirement occuper des niches intracellulaires et de cette façon échapper à un dégagement de cours normales de traitement antimicrobien et de sortir plus tard pour commencer de nouveaux cycles d'infection virulente. Staphylococcus aureus 1 et uropathogènes entérobactéries 2,3 infections sont deux exemples de plus en plus reconnus. Par conséquent, un objectif fondamental de découverte de médicament consiste à identifier de nouveaux agents antimicrobiens qui pénètrent dans les compartiments intracellulaires. Le traitement optimal pour éradiquer rapidementorganismes intracellulaires et de prévenir le développement de la résistance aux antimicrobiens par l'exposition sous-inhibitrice est particulièrement souhaitable.

À cette fin, nous avons développé une technologie de criblage à haut débit pour identifier les antimicrobiens intracellulaires-ressuage ciblant la croissance intracellulaire de l'agent pathogène du modèle, Legionella pneumophila. 4 observations cliniques antérieures indiquent que les tests de sensibilité aux antimicrobiens norme n'a pas prédire avec précision in vivo l' efficacité thérapeutique contre cet organisme. 5 Plus précisément, ce fut parce que les principales catégories d'antimicrobiens tels que les ß-lactamines et aminosides, bien que très efficace contre axéniquement cultivé Legionella, ne pénètrent pas suffisamment dans les compartiments intracellulaires où Legionella réside. 5,6 preuves plus tard suggéré que les essais de croissance intracellulaire techniquement plus complexes de manière efficace prédit l' efficacité clinique. 7 </sup> Malheureusement, ces essais ont été extrêmement laborieux points d'extrémité des essais, ce qui nécessite des macrophages infectés, traités avec des antimicrobiens, être lysées à différents moments de points pour former des colonies unité dénombrement. De tels essais ne sont pas pratiques à faire sur une grande échelle et ne conviennent pas à haut débit de découverte de médicaments.

Par conséquent, nous avons développé la technologie pour la détermination en temps réel de la croissance bactérienne intracellulaire. 6 Cela a été réalisé par l' utilisation d'une souche bactérienne modifiée par l' intégration soit une luciférase bactérienne opéron 8 (dosage de première génération a été décrite précédemment) , 4 ou protéine fluorescente 9 reporters (deuxième génération, le dosage orthogonaux, décrit ici) dans le chromosome bactérien. De cette façon, luminescent ou signal fluorescent fournit un substitut, la lecture en temps réel du nombre de bactéries.

Cependant, ces attributs ne traitent pas un facteur de confusion majeure dans infectio intracellulairen essais, les effets hors-cible sur les cellules hôtes. En particulier, la mort de la cellule hôte limite intrinsèquement la croissance intracellulaire et conduit à l'identification de faux positifs de l'effet antimicrobien. Comme de nombreux composés dans les bibliothèques de criblage sont cellules eucaryotes toxiques, ces faux positifs submergent vrais antimicrobiens, ce qui nécessite un grand nombre de suivi, des tests de cytotoxicité point final pour la résolution.

Ainsi, il était d'un grand intérêt pour être en mesure d'évaluer la viabilité des cellules eucaryotes et la croissance intracellulaire simultanément. En particulier, une caractéristique des cellules eucaryotes non viables est la perte d'intégrité de la membrane cellulaire. Les sondes qui testent la perméabilité de la membrane cellulaire peuvent donc être utilisés pour évaluer la viabilité cellulaire. Nous avons précédemment caractérisé l'aptitude d'une série de cellules putativement membrane, imperméants, des colorants de liaison à l'ADN fluorescent d'accès et de souiller l'ADN nucléaire des cellules mortes. 4 sur la liaison de l' ADN nucléaire, ces colorants présentent une forte augmentation Quantum rendement de fluorescence entraînant une augmentation de signal sur la fluorescence de la solution de fond. Par conséquent, ces colorants ont fourni une lecture quantitative de la mort cellulaire eucaryote. 4 Notamment, nous avons constaté que plusieurs étaient non toxiques eux – mêmes pendant la co-incubation prolongée avec les macrophages J774. Lorsqu'il est ajouté au cours de l'infection initiale, ils ont fourni en temps réel, la lecture de fluorescence de la mort cellulaire eucaryote qui peut être mesurée par un fluorimètre à microplaques ou observée au microscope.

Par conséquent, en combinant l'utilisation d'un journaliste bactérienne et non toxique, membrane-impermeant, colorants de liaison d'ADN, nous avons pu mettre au point un non-destructif, simple essai, en temps réel pour mesurer à la fois la charge bactérienne et eucaryote cytotoxicité cellulaire simultanément. Ce test nous a permis d'écran dans 384 puits format de plaque ~ 10.000 bioactifs connus, y compris ~ 250 antimicrobiens et> 240.000 petites molécules ayant une activité fonctionnellement non caractérisée par la capacité à inhiber la croissance intracellulaire deLegionella pneumophila, tandis que dans le même temps , la génération de données de cytotoxicité des cellules eucaryotes pour chaque composé. 6 Notre analyse des antimicrobiens connus contre la croissance intracellulaire de Legionella était l'exploration la plus complète de ce type à ce jour. 6

Sur la base de l'efficacité de notre format d'essai, nous avons également exploré ensuite les effets synergiques potentiels des antimicrobiens connus lorsqu'ils sont utilisés en combinaison. L'un des essais de synergie les plus courants, le dosage que l'on appelle damiers, est réalisée en évaluant la manière standard les effets combinatoires des dilutions en série de deux en deux de deux ou plusieurs agents antimicrobiens. 10 Dans ces essais, la synergie est définie par l'observation d' un effet plus important lorsque deux ou plusieurs agents antimicrobiens sont appliqués en même temps que la somme des effets de chacun appliqués séparément. Il convient de noter, jusqu'à présent, uniquement axé et les tests de synergie sélective a été réalisée contre intracellulaire Legionella pneumophila </em> à cause du grand effort impliqué dans les essais finaux traditionnels multiplié par les permutations combinatoires nécessaires.

Pour faciliter les tests de synergie, nous avons fait usage de notre temps réel la croissance intracellulaire / test de cytotoxicité eucaryote en combinaison avec la technologie de distribution numérique automatisé 6. Cette automatisation nous a permis de distribuer des dilutions en série des composés dissous dans du DMSO ou de la solution aqueuse seuls ou en combinaison dans un format à 384 puits. 11 En outre, cette technologie de traitement des liquides robuste nous a permis d'effectuer facilement une résolution plus élevée, la racine carrée de deux enfants (plutôt que la norme, une résolution inférieure, doublant) combinaisons de dilution pour atteindre des niveaux plus élevés de spécificité dans nos deux dimensions, checkerboard synergie une analyse. Cette résolution a été particulièrement précieuse pour répondre aux préoccupations en matière de synergie sur les reproductibilité lors de l' utilisation double série de dilutions 12. Enfin, notre analyse était quantitative et aussi thervant gradations d'inhibition mesurée. En conséquence, l'essai a capturé la totalité de l'information d'inhibition, exprimables dans isocontour isobologrammes dans lequel isocontours relier les concentrations combinatoires avec des niveaux similaires d'inhibition de la croissance. 6 Cette stratégie a permis la visualisation de tracé des courbes dose-réponse combinatoires. Pour illustrer notre méthodologie, nous décrivons notre protocole pour effectuer ces tests et montrer des résultats représentatifs.

Protocol

1. Temps réel intracellulaires croissance et cellules eucaryotes Essai de cytotoxicité Préparation de cellules hôtes (Cellules J774A.1) Les cellules de type macrophage Culture J774A.1 Mus en suspension dans RPMI 1640 avec 9% de sérum de veau fer complété. Un premier passage dans des flacons de culture tissulaire. Après que les cellules sont devenues confluentes dans 75 cm 2 flacon de culture tissulaire dans 15 ml de milieu, divisé par grattage et de dilution à 65 ml avec…

Representative Results

essai de croissance intracellulaire microplaque Figure 1 schématise les étapes d'essai. Les étapes automatisées indiquées peuvent être effectuées manuellement. Cependant, le débit est grandement facilité l'utilisation de systèmes de manipulation de liquides. La figure 2 montre des résultats représentatifs d'u…

Discussion

Nous décrivons des tests en temps réel pour la détection simultanée de la croissance bactérienne intracellulaire et la cytotoxicité des cellules hôtes. Il y a plusieurs étapes critiques dans le protocole. D'abord, pour les performances du test robuste, il doit y avoir une séparation spectrale suffisante entre les lectures bactériennes et cytotoxicité. Une telle séparation est intrinsèque des combinaisons de reporters opéron luciférase et des colorants de liaison à l'ADN fluorescents. Cependant, s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La recherche rapportée dans ce manuscrit a été soutenu par l'Institut national des allergies et des maladies infectieuses des Instituts nationaux de la santé sous le numéro d'attribution R01AI099122 à JEK Le contenu est uniquement la responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles des National Institutes of Santé. Nous tenons à remercier Jennifer Smith, David Wrobel, Su Chiang, Doug Flood, Sean Johnston, Jennifer Nale, Stewart Rudnicki, Paul Yan, Richard Siu, et Rachel Warden de la Facilité de dépistage BICE-Longwood et / ou le Laboratoire national de dépistage pour les nouveaux centres régionaux d'excellence en Angleterre biodéfense et les maladies infectieuses émergentes (pris en charge par U54AI057159) pour leur aide dans le développement et la performance des essais de criblage à haut débit. Nous tenons également à remercier Kenneth P. Smith pour leurs commentaires utiles sur le manuscrit.

Materials

J774A.1 cells American Type Culture Collection TIB-67 Host cell
ACES Sigma-Aldrich A9758  For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Yeast extract, ultrafiltered Becton-Dickinson/Difco 210929 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; lower grades may cause impaired growth and/or alter sensitivity of Legionella to growth inhibitors
Alpha-ketoglutaric acid, monopotassium salt Sigma-Aldrich K2000 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Potassium phosphate, dibasic Thermo Fisher Scientific P288-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
L-cysteine Sigma-Aldrich C-7755 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Ammonium iron(III) citrate Sigma-Aldrich F5879 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium; ferric pyrophosphate may be used instead but is more difficult to weigh accurately
Potassium hydroxide solution, concentrated Thermo Fisher Scientific SP236-500 For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Deonized water N/A N/A For making buffered charcoal yeast extract agar and buffered yeast extract medium
Thymidine (tissue culture grade) Sigma-Aldrich T1895 For supplementing both RPMI 1640 and buffered yeast extract agar/medium — lower grade thymidine may be used for the latter, but may cause impaired cell growth and/or cell death in RPMI 1640
RPMI 1640, standard formulation Corning via Thermo Fisher Scientific 10-040-CV For growing J774A.1 cells prior to plating; includes 2 mM L-glutamine
RPMI 1640 lacking phenol red Corning via Thermo Fisher Scientific 17-105-CV For plating J774A.1 cells in 384 well dishes (not suitable for growth prior to plating); also lacks L-glutamine — supplement to 2 mM before use
L-glutamine, 200 mM in 0.85% NaCl (tissue culture grade) HyClone via Thermo Fisher Scientific SH30034.02 For supplementing RPMI 1640 lacking L-glutamine, to 2 mM final concentration
Iron-supplemented calf serum Gemini Bioproducts 100-510 For supplementing RPMI 1640, to 9.1% final concentration
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich T8154 For staining for J774A.1 cell death determination while counting cell density
SYTOX Green, 5 mM solution in DMSO Thermo Fisher Scientific S7020 For staining for J774A.1 cell death determination by fluorescence reading or epifluorescence microscopy (in conjunction with orange-red or far red fluorescent bacteria). Use at 125 nM final concentration.
GelRed, 10000X solution in water Biotium 41003 For staining for J774A.1 cell death determination by epifluorescence microscopy (in conjunction with green fluorescent bacteria). Use Gel Red  at 1X final concentration.  
Cell culture incubator Thermo Fisher Scientific 13-255-26 For incubation of J774A.1 cells (both before and after infection); can also be used for incubation of bacteria, or a standard atmosphere incubator can be used instead)
Orbital shaker BellCo Glass 7744-01010 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; fits inside cell culture incubator; includes shaker base 7744-01000 and tray 7740-01010 (these are also available separately)
Shaker flasks (250 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-04 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (250 ml) BellCo Glass 7744-16250 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker flasks (1000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-2038-07 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Shaker clamps for flasks (1000 ml) BellCo Glass 7744-16100 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection
Sponge foam caps for flasks (250 ml – 1000 ml) ChemGlass Life Sciences CLS-1490-038 For shaking incubation of J774A.1 cells before infection; reduces risk of contamination relative to standard metal caps
MultiDrop Combi programmable multichannel peristaltic pump Thermo Fisher Scientific 5840300 For dispensing J774A.1 cells, medium, and bacterial suspension containing fluorophores to large numbers of 384 well dishes
Combi standard bore manifold Thermo Fisher Scientific 24072670 Default predispense volume of 20 ml is insufficient to compensate for settling — increase to 80 ml
White 384 well dishes treated for tissue culture Corning 3570 For reading luminescence and fluorescence; Greiner catalog # 781080 also tested successfully
DMSO (tissue culture grade, in sealed ampoules) Sigma-Aldrich D2650 For dissolving positive control and test compounds
Azithromycin Sigma-Aldrich PHR1088 Antibiotic positive control
Saponin (from Quillaja bark) Sigma-Aldrich S-4521 Cytoxicity positive control
Multichannel pipettor Thermo Fisher Scientific Finnpipette For transfer of fixed amounts of positive control compounds; pipettor must have digital dispensing with detents to enable repetitive fixed volume dispensing
Epson pin transfer robot Epson/ICCB-L (Custom equipment) For transfer of fixed amounts of test compounds from library arrays
 D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan D300 For transfer of variable amounts of test compounds ranging from 11 picoliters to 10 microliters
T8+ cartridges for D300 digital dispensing system Hewlett-Packard via Tecan T8+ For dispensing test compounds
EnVision multi-mode plate reader Perkin-Elmer (Contact manufacturer) For optimal detection of SYTOX Green fluorescence, use excitation filter 485/14, emission filter 535/25, and dichroic mirror 505 nm, with selection of minimum gain and transmittance, and “high concentration mode. For luminescence detection, use the "USLUM" protocol for high-sensitivity detection. For mNeptune2 detection, use excitation filter 600/8, emission filter 665/7.5, and dichroic mirror 658 nm, with selection of gain and transmittance to achieve the highest maximum signal possible without saturating the photomultiplier.
Epifluorescence microscope with computer-connected digital camera Nikon Ti For live cell imaging; any standard fluorescent microscope can substitute, with phase contrast or DIC optics, capable of imaging green (fluorescein), orange-red to red (Texas Red), and far-red (Cy5) fluorescence, with 100X oil objective for highest resolution
Glass-bottom tissue culture dishes MatTek Corporation P35G-1.5-20-C For live cell imaging. Dishes such as the MatTek allow microscopic visualization at 600X or 1000X magnification through use of an inverted epifluorescent or confocal microscope.  These specific dishes are 3.5 cm nominal diameter, 3.3 cm inside diameter, with 20 mm diameter #1.5 thickness cover slips inserted into the bottoms.
Photoshop CS6 Adobe Adobe photoshop or similar programs can be used to pseudocolor and merge light microscopic and fluorescent images.
Mathematica 10 Wolfam For generation of two-dimensioonal isocontour isobolograms and three-dimensional surface isobolograms.

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Chiaraviglio, L., Kang, Y., Kirby, J. E. High Throughput, Real-time, Dual-readout Testing of Intracellular Antimicrobial Activity and Eukaryotic Cell Cytotoxicity. J. Vis. Exp. (117), e54841, doi:10.3791/54841 (2016).

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