نحن هنا وصف طريقة للحصول على وتحديد جزء من السكان تتميز حديثا من البالعات عملاق المستمدة من العدلات. هذه الخلايا تنمو في الثقافة من العدلات الدم البشري الطازج، وتتميز البلعمة، الالتهام الذاتي، وحجم كبير جدا، وعمر ممتد. هذا الأسلوب هو ضروري لمواصلة التحقيق هذا فريدة من نوعها حيوانية المستمدة من العدلات.
العدلات (السوداء) واشتهر مهامهم أكلة ضد غزو الجراثيم والميكروبات. لديهم أقصر فترة نصف العمر بين الكريات البيض وفي حالتها غير المفعلة ملتزمون بشكل جوهري إلى موت الخلايا المبرمج. عندما تجنيدهم للمواقع التهابات حل التهاب، فإنها تنتج مجموعة واسعة من الجزيئات السامة للخلايا مع قتل المضادة للجراثيم قوية. ومع ذلك، عندما يتم إطلاق هذه الجزيئات السامة للخلايا قوية بطريقة غير المنضبط أنها يمكن أن تتلف الأنسجة المحيطة بها. في السنوات الأخيرة ومع ذلك، ويتجلى تعدد العدلات على نحو متزايد، من خلال إظهار وظائف اللدونة وimmunoregulatory. لقد حددنا مؤخرا جزء من السكان المستمدة من العدلات الجديد، الذي يتطور من تلقاء أنفسهم في ظروف ثقافة القياسية بدون إضافة عوامل السيتوكينات / النمو مثل محببة عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF) / انترلوكين (IL) -4. قدراتهم أكلة من بقايا العدلات تسهم إلى حد كبير في زيادة قدرتهاحجم هائل. البالعات العملاقة بالتالي فإنها وصفت بأنها (Gφ). على عكس العدلات، وعاش Gφ طويل في الثقافة. وهي تعبر عن مجموعة من التمايز (CD) علامات العدلة CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / الميلوبيروكسيديز (MPO) / الإيلاستاز العدلات (NE)، وتكون خالية من الوحيدات علامات النسب CD14 / CD16 / CD163 وشجيري علامات CD1c / CD141 . كما أنها تأخذ ما يصل اللاتكس وزيموزان، والاستجابة من قبل انفجار التأكسدي للتحفيز مع opsonized-زيموزان وسلطة النقد الفلسطينية. Gφ أيضا أن أعرب عن زبال مستقبلات CD68 / CD36، وعلى عكس العدلات، استيعاب أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة (oxLDL). وعلاوة على ذلك، على عكس العدلات جديدة، أو وحيدات مثقف، والرد على oxLDL امتصاص عن طريق زيادة إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS). بالإضافة إلى ذلك، فإن هذه الخلايا البالعة تحتوي المرتبطة أنيبيب بروتين-1 سلسلة ضوء 3B (LC3B) فجوات المغلفة، مما يدل على تفعيل الالتهام الذاتي. باستخدام مثبطات معينة فمن الواضح أن كلا من البلعمة والالتهام الذاتي هي prerequisiقسم التدريب والامتحانات لتنميتها وNADPH المرجح أوكسيديز ROS يتوقف. نحن هنا وصف طريقة لإعداد هذه حيوانية جديدة من الخلايا البلعمية المستمدة من العدلات طويلة الأجل في الثقافة والهوية وخصائصها المعروفة حاليا. هذا البروتوكول هو ضروري للحصول على وتميز Gφ من أجل مواصلة التحقيق في أهمية وظائفها.
العدلات النوى (السوداء) تشكل أكبر عدد الكريات البيض في الدم، بمثابة خط الدفاع الأول ضد غزو الجراثيم من خلال إنتاج مجموعة واسعة من الجزيئات السامة للخلايا. وكانت وجهة النظر التقليدية منذ فترة طويلة أن تعميم الدم، يدم طويلا، البالعات المهنية، والتي هي أول من يصل إلى مواقع التهابات حادة لمكافحة العدوى والمساعدة في إزالة مسببات الأمراض والجزيئات الضارة. 1 في دولتهم غير المفعلة، العدلات ملتزمة بشكل جوهري إلى موت الخلايا المبرمج. عند الانتقال من الدم إلى مواقع التهابات، والعدلات تخضع تفعيل لحل التهاب. هم أن phagocytose وقتل الكائنات الحية الدقيقة الغازية، من خلال إنتاج مجموعة واسعة من الجزيئات السامة للخلايا أنواع الاكسجين التفاعلية مثل (ROS)، والأنزيمات التحللي كالإيلاستاز العدلات (NE) وcathepsins مع نشاط ميكروبات قوية. من أجل مسببات الأمراض فخ، العدلات أيضا إطلاق سراح الفخاخ خارج الخلية (المستجدة) والتي تتكون من المواضيع ونين النووية التي تحتوي على الببتيدات المضادة للبكتيريا والإنزيمات المختلفة التحللي. ومع ذلك، جامحا لهذه الجزيئات السامة للخلايا من العدلات يمكن أيضا إدامة الاستجابات الالتهابية وحمل الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها. 2 لذلك، وإزالة فعالية العدلات أفكارك الضامة (Mφ) والخلايا الجذعية (DC) أمر حاسم لحل التهاب. 3، 4، 5، 6
في السنوات الأخيرة ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن العدلات هي غاية خلايا متعددة الاستعمالات، التي تذهب إلى ما هو أبعد البلعمة وقتل الممرض وظائف. 6 و 7 بواسطة تمر فتيلة أو التنشيط، العدلات اللدونة تكتسب اهتماما تدريجيا. عرضت العدلات على سبيل المثال، تحدى البكتيريا والمتفطرات لتفرز انترلوكين (IL) -10 والسيطرة على الاستجابة الالتهابية، مما يشير إلى وجود استجابات المناعية التنظيمية. وقد أظهرت 8 العدلات بعد الإنقسامية إلى عبر التمايز إلى خلايا Mφ تشبه، أو خلايا DC-مثل قبل هضم وعرض أجزاء المستضد عندما تعامل مع السيتوكينات وعوامل النمو، 9، 10 وبالتالي، يخدم دورا حاسما في دمج الفطرية والتكيفية الردود. 3 و 6 تنشيط عوامل النمو الترويج ابتلاع العدلات أفكارك أو الحطام الخلية، وبالتالي، تسهيل إزالة الأنقاض في مواقع التهابات وحل التهاب، 3، 9 خاصة عندما يكون نظام التخليص Mφ / DC غير كاف أو طغت، 11، 12 مما يشير إلى احتمال "التنظيم الذاتي" للمساعدة في إعادةحل الاستجابة الالتهابية. هذا، منذ موت الخلايا المبرمج هو شكل من أشكال التنظيم الموت الذاتي التي يمكن أن تحول دون الإفراج خارج الخلية من المركبات السامة للخلايا وبالتالي منع إصابة الأنسجة المحيطة بها. 6
البقاء على قيد الحياة لفترة طويلة هو ميزة أخرى لتفعيل العدلات وتجلى عن طريق العلاج مع مختلف العوامل المضيفة المشتقة مثل محببة عامل تحفيز مستعمرة (G-CSF)،-محببة بلعم عامل تحفيز مستعمرة (GM-CSF)، السيتوكينات الالتهابية مثل الانترفيرون ( IFN) -γ، عامل نخر الورم (TNF) -α و / أو الممرض المنتجات المشتقة، وبالتالي السماح العدلات لتعدل استجابة بقائهم على قيد الحياة. 6 في الواقع، بقاء العدلات هو شرط أساسي ليونة، وكان مرتبطا مع قدرتها على أداء البلعمة. 6، 13 وبناء على ذلك، فقد تبين أن أشرك في المظهرية والوظيفية التغييرات التي depenدائرة التنمية الاقتصادية على التعبير الجيني upregulated عن طريق حفز تركيب البروتينات الجديدة تشارك في تمديد عمر العدلات، وتتضاءل موت الخلايا المبرمج. 10
على عكس العدلات التي هي قصيرة الأجل وجوهري الخضوع لموت الخلايا المبرمج في الثقافة، أو العدلات تنشيط عوامل السيتوكينات / النمو، المذكورة أعلاه، والتي قمنا بمد عمر، حددنا مؤخرا، حيوانية صغيرة جديدة من العدلات الذي يتطور بشكل عفوي في الثقافة المعيارية لفترات طويلة الشروط من العدلات الدم الإنسان المعزولة حديثا دون إضافة خارجيا السيتوكينات أو عوامل النمو. 14 البالعات العملاقة وتسمى هذه الخلايا المشتقة العدلات، والتي لم توصف من قبل في الأدب (Gφ). وGφ قمنا بمد عمر في الثقافة، ويتم تطويرها بالكامل في حدود 5-7 أيام، وتتميز ملامح شكلية فريدة من نوعها، والتعبير المظهري وظائف. يتم تكبير أنها إلى حد كبير نتيجة لautophagocytosis من بقايا المتعادلة الميتة، ظهور تجاويف، ويحتوي على جسيم حال بلعمي. وGφ تعبير عن حبيبات العدلات علامة محددة – مجموعة من التمايز (CD) 66B، علامات حبيبات أليف اللازورد – CD63 والميلوبيروكسيديز (MPO) وعلامات العدلات إضافية مثل CD11b، NE، CD15، مفارز NADPH أوكسيديز gp91- phox وp22- phox، و-LC3BII الالتهام الذاتي علامة. 14، 15 وظيفيا، وبنشاط اتخاذ المتابعة حبات اللاتكس والجسيمات زيموزان، وتوليد ROS ردا على زيموزان وphorbol 12 ميريستيت 13-خلات (سلطة النقد الفلسطينية) التحفيز. ومن المثير للاهتمام، على عكس العدلات جديدة، Gφ أيضا عن بكثافة مستقبلات زبال CD68 و CD36، اتخاذ المتابعة أكسدة البروتين الدهني منخفض الكثافة (oxLDL)، وتوليد ROS ردا على التحفيز مع oxLDL. بالإضافة إلى ذلك، Gφ تخلو من علامات نسب الوحيدات CD14، CD16 وCD163 أو علامات شجيري CD1c وCD141. وعلاوة على ذلك، فاgocytosis والالتهام الذاتي، ومن المرجح الوظيفي أوكسيديز NADPH هما شرطان أساسيان لتنميتها. هذه منذ، البلعمة المانع cytochalsin باء، ومثبطات الالتهام الذاتي 3-methyladenine (3-MA) وbafilomycin (BafA1) وNADPH أوكسيديز المانع – diphenylene iodonium (DPI) – منع تطورها. بالإضافة إلى ذلك، وحيدات / العدلات المشترك الثقافات وكذلك التعرض لنقص الأكسجين المتقطع يعوق تنميتها، في حين أن التكيف العدلة لنقص الأكسجين المستمر واضحا. 14،15 ويتضح منها تطوير المقترحة في الثقافة في الشكل 1 البروتوكول. وفي هذه الورقة تصف خطوة بخطوة إعداد Gφ من المعزولة حديثا تعميم العدلات الدم البشرية وتطورها، وتحديد وبعض الخصائص الأساسية. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لمواصلة التحقيق والكشف عن طيف واسع وأدوار هذه صفها حديثا وفضول العدلة المستمدة Gφ من أجل characterizالبريد أهميتها ووظائفها المحتملة.
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لتنمية الخلايا العملاقة في 7 الثقافات يوم العدلات. ويقترح أن في مواقع التهابات (1) العدلات الخضوع موت الخلايا أفكارك، و(2) طوقت غشاء الإفراج شظايا تحتوي على الحطام النووي، حبيبات (الأخضر والنقاط الحمراء)، وغيرها من المكونات الخلوية التي تؤدي آليات الالتهام الذاتي. (3) البالعات العملاقة (Gφ) وضع في الثقافات العدلات على المدى الطويل خالية من السيتوكينات أو عوامل النمو من خلال استيعاب الهيئات أفكارك والحطام العدلات، مع الحفاظ على وظيفية oxidase.They NADPH تتميز مختلف النيتروفيل CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / علامات NE، جسم بلعمي كبيرة تضم حبيبات والحطام الخلية، ومستقبلات زبال CD36 و CD68. جيجابايت1؛ هي خلايا mononucleated في الغالب، قادرة على استيعاب أيضا العديد من الأجسام وLDL المؤكسد وتوليد ROS. الأغشية من فجوات ملء Gφ تحتوي LC3B (ملحوظ في الزرقاء الداكنة)، علامة غشاء autophagosomal، مما يشير إلى وجود ارتباط بين صارمة الالتهام الذاتي وتشكيل بلعمية العملاقة. Gφ لا تتطور في المتوسط تحتوي على GM-CSF / IL-4. أيضا، مثبطات مثل أوكسيديز المانع NADPH – diphenylene iodonium (DPI)، ومثبطات الالتهام الذاتي 3-methyladenine (3-MA) وbafilomycin (BafA1) والبلعمة المانع مثبط حركة الخلايا B (. خلوي ب) بإلغاء تشكيلها. (4) ويمكن أن تشمل وظائف Gφ المحتملة في الجسم الحي خصائص مضادة للأو الموالية للالتهابات والمشاركة في عمليات تصلب الشرايين (ويستند هذا الرقم على النتائج التي توصلنا إليها 14 و 15 و تم تعديلها من التحرير المصاحب التي كتبها Berton 20). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
البالعات العملاقة (Gφ) هي جزء من السكان المعرفة حديثا من الخلايا المشتقة العدلات معربا عن علامات أساسية ومحددة عدلة مثل CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. لم يكن وصف هذا النوع من بلعمية المستمدة من العدلات في الأدب من قبل. على عكس العدلات التي هي قصيرة الأجل والخضوع لموت الخلايا المبرمج، Gφ هي Annexin-V-السلبي وعرض عمر الموسعة. ومع ذلك، ومثل العدلات، Gφ أيضا استيعاب جزيئات وإنتاج ROS NADPH أوكسيديز التي تعتمد استجابة لهذه الجزيئات وسلطة النقد الفلسطينية. ومع ذلك، قدراتهم على استيعاب OxLDL وبالتالي إلى إنتاج ROS هي ميزات فريدة من Gφ. 14
وقد أظهر عدد من العوامل التي تؤثر على تنميتها في الثقافة. عدم وجود السيتوكينات خارجية أو عوامل النمو في متوسط النمو ضروري (على وجه التحديد GM-CSF / IL-4). ومع ذلك، أثبتت العدلات الهجرة نحو IL-8 عامل تميز بين تلك التي ديفهربت إلى Gφ وتلك التي لم تفعل ذلك. أيضا، واستيعاب من الحطام الناجم عن العدلات أفكارك، والتعبير عن البروتينات الالتهام الذاتي (LC3B) وظيفية أوكسيديز NADPH، وعرضت كل أمرا حتميا لتنميتها، منذ تثبيط على منع تشكيل Gφ (الشكل 1). على ما يبدو، وتطوير هذه الخلايا العملاقة الناشئة من العدلات تختلف عن تلك التي تميز تشكيل خلية عملاقة في الوحيدات / النسب بلعم. شكل متعددة الأنوية خلايا عملاقة الأخيرة المرتبطة بالأمراض المختلفة المزمنة التهابات و 20 و 21 في حين أن Gφ العدلات وصفها هنا تطوير عبر autophagocytosis، التي تجتاح بقايا الخلايا وتبقى في الغالب أحادي الأنوية في جميع أنحاء تنميتها، 14 (نادرا ومع ذلك، في بعض الأحيان ثانية نواة يمكن ملاحظة). وعلاوة على ذلك، أنشأ عدد من الضوابط أصلهم العدلات: (1) expression من علامات neutropilic محددة وغياب شجيري ونسب الوحيدات علامات، (2) تعوق التنمية في حيدات / PMN المشترك الثقافات، (3) أنماط المختلفة من الحركة في الثقافة من الضامة (كما يتضح من تصوير الخلايا الحية والوقت المجهر -lapse)، 14 (4) الالتزام الضوء على الأطباق البلاستيكية و (5) تنميتها من CD15 النقي + / CD14 – PMN التي حصل عليها التدفق الخلوي.
بعض المهام المحددة في المختبر قد تعطينا أدلة إلى الوظائف المحتملة في الجسم الحي. على سبيل المثال، قدرات Gφ تستهلك كميات كبيرة من حبيبات العدلات والحطام، وجود فجوات كبيرة، وLC3B التعبير – وهو البروتين الالتهام الذاتي الذي يساهم في تقليل الالتهاب من خلال التفاعلات التنظيمية مع الفطرية مسارات الإشارات المناعة، 22 – جميعها قدرات الدعم الكسح. كما، تشير هذه النتائج أيضا أن Gφ يمكن أن تعمل في مواقع التهابات حيث نظام Mφ / DC غير كاف أو طغت، وبالتالي تسهم في حل الالتهابات. قد تكون معتمدة هذه الفكرة من خلال حقيقة أن يعيش فيه خليط الثقافات الوحيدات / العدلة ويعوق تنمية Gφ. 14 أيضا، بالنظر إلى أن Gφ التعبير عن مستقبلات oxLDL زبال (CD36، CD68)، استيعاب oxLDL، وإنتاج روس ردا على ذلك، قد يشير إلى أنهم يشاركون في عمليات تصلب الشرايين لحل التهاب. منذ Gφ وضعت فقط من العدلات التي هاجرت نحو IL-8، وهجرة العدلات "عبر الطبقات الوحيدة البطانية نحو IL-8 يمثل تجنيد العدلات إلى مواقع الالتهابية الحادة، هذه النتيجة أيضا يمكن أن تدعم وظائف المضادة للالتهابات. على العكس من ذلك، فإن أداء Gφ في بعض حالات الالتهابات قد تمكينهم من أداء المكونات الحبيبية وROS، وبالتالي المساهمة في فيالتهاب sistent وتلف الأنسجة. 20 ومع ذلك، عموما، تشير قدراتهم ذاتية البلعمة أن Gφ ويشارك على الأرجح في تناقص الاستجابة الالتهابية بدلا من إدامة ذلك.
ومن المثير للاهتمام حددنا مؤخرا وجود Gφ في لويحات تصلب الشرايين الإنسان. (قيد التحضير). ومع ذلك لا يزال هناك عدد كبير من الأسئلة التي يتعين انحلت. على سبيل المثال، هي Gφ المؤيدة أو المضادة للالتهابات؟ ما هي العوامل التي تحدد تشكيل وظيفة في المختبر أو في الجسم الحي؟ الذي محددة العدلات حيوانية هو خلية سلائفها التي تسهل تنميتها في Gφ؟ هم المرتبطة ببعض الأمراض والتي؟ بشكل جماعي، يطرح أسئلة مثيرة للاهتمام على أساس الأصل والوظائف المحتملة.
يجب أن تبقى الخطوات والعثرات ولكن حاسمة في البروتوكول في الاعتبار. خطوة حاسمة في تطوير Gφ طالصورة زراعة العدلات نقية في تخلو المتوسط السيتوكينات وعوامل النمو أو المضادات الحيوية. خطوة حاسمة أخرى هي يستبعد أن Gφ تطوير من حيدات تلويث والتأكد من أصل العدلات من Gφ. وهكذا، بعد فصل الدم عن طريق التدرج متقطع، تعرضوا العدلات أبعد إلى خطوة إضافية لتنقية التدفق الخلوي باستخدام النابضة محببة وCD15 + / CD14 – علامات. وGφ المتقدمة التي تم الحصول عليها من العدلات التي تم تنقيتها من جراء التدفق الخلوي الانفصال لم تختلف عن تلك التي لم تتعرض لهذه الخطوة من تنقية. لذلك، أجريت معظم التجارب دون التدفق الخلوي خطوة لتنقية بسبب فقدان الخلايا إضافية. وتجدر الإشارة، في بعض الحالات النادرة لوحظت بعض الحمضات في الثقافة. بقي حجمها دون تغيير طوال الفترة الثقافة. يجب أن نلاحظ أيضا أنه على الرغم من أن هناك عددا من الطرقلفصل العدلات من الدم البشري، والطريقة الموصوفة هنا هو الأسلوب الوحيد الذي يعمل، وبالتالي فإننا لا يمكن مقارنة التطور Gφ عن طريق وسائل أخرى متاحة للانفصال العدلة.
والمعضلة الأساسية في التحقيق Gφ النتائج من عدم القدرة على الحصول على عدد كاف من السكان Gφ النقي مناسبة لمختلف فحوصات البيوكيميائية. فمن المستحيل أساسا في الظروف أجريت تجاربنا. أولا، العائد من Gφ منخفض. من 1.0 × 10 6 المصنف PMN حول 100-200 Gφ تطوير بعد سبعة أيام في الثقافة، وهذا يتوقف على التبرع بالدم. ثانيا، فمن الصعب أساسا في الوقت الراهن لفصل Gφ نموا في الثقافة من تحت الانقاض العدلات المتبقية في طبق. جعلت هذه القيود من المستحيل عمليا لتحليل الخلايا عن طريق أساليب البيولوجيا الحيوية أو الجزيئية. ولذلك، يركز هذا البروتوكول في واصفا تحديد Gφ وظيفة باستخدام الضوءوالفحص المجهري متحد البؤر. وأعقب على التحول الصرفي من العدلات إلى Gφ في الثقافة أيضا تصوير الخلايا الحية والفاصل الزمني المجهر. 14 ما يبدو، قد تكون هناك حاجة إلى كميات الدم أكبر من ذلك بكثير من أجل تنفيذ طرق البيولوجيا الحيوية أو الجزيئية والتغلب على العائد المنخفض التي تم الحصول عليها والتي تفصل بين Gφ قابلة للحياة من تحت الانقاض العدلات "في الطبق.
باختصار، لقد وصفنا مؤخرا لأول مرة تطوير Gφ في الثقافة، وجزء من السكان من الخلايا البالعة طويلة الأجل من أصل العدلات. لذلك، هذا هو الأسلوب الوحيد المتاح حاليا للحصول على Gφ في الثقافة، على الرغم من أن اثنين من القيود الرئيسية المذكورة أعلاه يجب التغلب عليها (العائد المنخفض للGφ الحصول في الثقافة وعدم القدرة على فصل Gφ المتقدمة من تحت الانقاض العدلات في الثقافة طبق). لا يزال، وإعداد وتحديد الهوية، وقدمت في هذا البروتوكول، هو ESSENTIAل للعلماء المهتمين في الاستجابات الالتهابية والبيولوجيا العدلة واللدونة، من أجل مواصلة التحقيق في أهمية والوظائف المحتملة للGφ.
The authors have nothing to disclose.
الكتاب أشكر الدكتور إديث سوس-توبي لها مساعدة لا تقدر بثمن مع دراسات المجهر مبائر. وأيد هذه الدراسة من قبل وزارة الاستيعاب ولجنة التخطيط والميزانية في مجلس التعليم العالي في إطار برنامج KAMEA (LD وا ف ب). نحن أيضا الامتنان الدعم للزميل باحث من السيدة ديفيس مؤسسة ما بعد الدكتوراه زمالة أبحاث (أو).
Sterile scalp vein set (21GX3/4) | Bio Diagnostics Ltd. | # 20080312 | A strile needle for venipancture |
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP | Greiner Bio-One | # 450263 | For securing during venipuncture |
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16×100/9 ml) | Greiner Bio-One | # 455036 | Sterile tube for blood collection |
Nunclon MultiDish (24 wellx1ml) | Thermo Scientific | # 142475 | |
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml) | Greiner Bio-One | # E14103PJ | |
Transwell-24 well (transmigration assay) | Corning | # CA-3415 | Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores) |
RPMI-1640 medium | BioIndustries | # 01-100-1A | Do not add antibiotics |
EA.hy926 (ATCC CRL2922) | BioIndustries | # CRL-2922 | |
ATCC-formulated Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | BioIndustries | # 302002 | complete growth medium |
Polysucrose – Histopaque1119 | Sigma-Aldrich | # 1119-1 | Tissue culture grade |
Polysucrose – Histopaque1077 | Sigma-Aldrich | # 1077-1 | Tissue culture grade |
Phosphate buffered saline (PBS) – ion free | BioIndustries | # 02-023-1A | Cell biology and molecular biology grade |
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS) | BioIndustries | # 04-121-1B | Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS |
NaCl | Sigma | # S3014 | Molecular biology grade, suitable for cell culture |
Paraformaldehyde, 16% | Electron Microscopy Sciences | # 15710 | Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA) |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | # 9002-93-1 | Molecular biology grade |
Normal Goat Serum | BioIndustries | # 04-009-1 | Cell biology and molecular biology grade |
Trypan blue | BioIndustries | # 031021B | Tissue culture grade |
May-Grünwald | Sigma-Aldrich | # MG500 | Cell biology grade-(procedure No GS-10) |
Giemsa stain Kit | Sigma | # 48900 | Cell biololgy grade-(procedure No GS-10) |
Fibronectin | BioIndustries | # 03090105 | |
Human Interleukin-8 (CXCL8) | PeproTech | # 200-08-5 | |
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-58951 | Mouse IgG2b; expressed by monocytes |
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5) | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-5275 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
Anti-CD66b (clone 80H3) | AbD Serotec | # MCA216 | Mouse IgG1; expressed by neutrophils |
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7) | MACS Miltenyi Biotec | # 130-090-695 | Mouse IgG2a; expressed by dendritic cells |
Anti-CD15 (clone MY-1) | Abcam | # ab754 | Mouse IgM; expressed by neutrophils |
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1) | BioLegend | # 650001 | Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex |
Anti-CD68 | Protein Tech | # 16192-1-AP | Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor |
Anti-LC3B | Sigma | # L7543 | Rabbit IgG |
Anti-Myeloperoxidase | Abcam | # ab45977 | Rabbit IgG |
Anti-Neutrophil elastase | Calbiochem | # 481001 | Rabbit IgG |
Anti-NOX2 (gp91-phox) | Abcam | # ab131083 | Rabbit IgG |
Anti-CD36 (SR-B3) | Novus Biologicals | # NB400-144 | Rabbit IgG |
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45) | BioLegend | # 401401 | Antibody used as isotype control |
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173) | BioLegend | # 400263 | Antibody used as isotype control |
Normal rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnologies | # sc-2027 | Antibody used as isotype control |
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20012 | Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A |
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Biotium | # 20043 | Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647 |
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20010 | Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A |
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Biotium | # 20040 | Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647 |
Fluorescent Mounting Medium with DAPI | Vectashield H-1000; Vector Lab Inc. | # E19-18 | Nuclear staining |
Confocal laser scanning microscope (LSM 700) | Carl Zeiss | Ser.# 3523000380 | Plan Apo x40 immersion oil objective |
Zeiss CLSM software (ZEN 2010) | Carl Zeiss MicroImaging GmbH | version 6.0 | For colocalization analysis |
ImageJ software | Wayne Rasband, NIH, USA | version 1.49k | For determination of cell areas and fluorescence intensity |
Light microscope (Axiovert 25) | Carl Zeiss | Ser.# 201060153 | Examination of cells in culture |
Centrifuge (Megafuge 1.0 R) | Heraeus Instruments | # D-37520 | Cells separation from blood; cytospins preparation |
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1) | Carl Zeiss | Ser.# 3834001470 | Demonstration of giant phagocytes development |
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box) | Life Imaging Services | Temperature control system for microscopes | |
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm) | Carl Zeiss | Ser.# 117090279 | For capturing high-contrast image data from an examined cell objects |