Summary

La visualización de los Efectos de esputo en el desarrollo del biofilm mediante un modelo de Septadas cubreobjetos

Published: December 14, 2016
doi:

Summary

This protocol describes the visualization of biofilm development following exposure to host-factors using a slide chamber model. This model allows for direct visualization of biofilm development as well as analysis of biofilm parameters using computer software programs.

Abstract

Las biopelículas consisten en grupos de bacterias encapsuladas en una matriz de auto-secretada. Juegan un papel importante en la contaminación industrial, así como en el desarrollo y persistencia de muchas infecciones relacionadas con la salud. Una de las biopelículas más bien descritos y estudiados en la enfermedad humana se produce en la infección pulmonar crónica de los pacientes con fibrosis quística. Al estudiar biofilms en el contexto del huésped, muchos factores pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas. Con el fin de identificar cómo los factores del huésped pueden afectar a la formación y el desarrollo de biopelículas, se utilizó un método cubre objetos de cámara estática para crecer biopelículas en presencia de factores derivados del huésped en forma de sobrenadantes de esputo. Las bacterias se sembraron en cámaras y se expusieron a filtrados de esputo. Después de 48 h de crecimiento, las biopelículas se tiñeron con un kit de viabilidad comercial biopelícula antes de la microscopía confocal y análisis. Tras la adquisición de imágenes, las propiedades del biofilm pueden evaluarse utilizando diferentes plataformas de software.Este método nos permite visualizar las propiedades clave de la formación de biopelículas en presencia de diferentes sustancias, como los antibióticos.

Introduction

biopelículas bacterianas son grupos de microorganismos que están unidos entre sí y encerrados en una matriz de auto-secretada. 1,2 Clásicamente, que representan bacterias unidas físicamente a una superficie abiótico o biótico formado bajo condiciones de flujo. Las biopelículas también se han demostrado para crecer en condiciones estáticas (ausencia de flujo) y distal de las superficies, tales como en la interfase aire-líquido de piscinas térmicas o unas películas formadas en tubos de ensayo. Estas biopelículas hace tiempo se reconoce en el medio ambiente y son un detrimento importante para los procesos industriales, ya que se pueden formar en los depósitos de agua o en las tuberías, lo que resulta en la contaminación biológica, la corrosión y los bloqueos. 3,4

Las biopelículas son también críticos en establecimientos de salud, ya que se ha demostrado estar implicado en infecciones relacionadas con el catéter, infecciones pulmonares en pacientes con fibrosis quística, así como en numerosas otras infecciones. 5,6 Uno de los rasgos distintivos de las infecciones biofilm es el dearrugado susceptibilidad de las bacterias a los antibióticos y deficientes despeje de la sistema inmune innato. 7-9 El más estudiados, escenarios clínicamente relevantes que supongan una infección basada en la biopelícula se produce en pacientes con fibrosis quística (FQ), que están infectados crónicamente con las biopelículas de Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa puede someterse a una serie de cambios durante el establecimiento de la infección crónica que la hacen muy difícil de tratar. 10,11 Las biopelículas pueden activar diferencialmente la inmunidad innata y conducir la inflamación. 12-14 Como estas infecciones provocan un aumento de la morbilidad y la mortalidad en los pacientes con FQ, es crucial para entender los factores que pueden afectar el desarrollo del biofilm en este contexto.

Un estudio reciente sugiere que host-factores son críticos en la formación de agregados de biopelícula P. aeruginosa. 15 Estas biopelículas contribuyen a la reducción de la susceptibilidad a los antibióticos y los mecanismos de defensa del huésped. el presena vez de factores derivados del huésped, tales como la elastasa de neutrófilos, así como productos secretados a partir de microorganismos presentes en el pulmón con FQ, tienen el potencial para modular en gran medida la formación y el desarrollo de biopelículas. 16 Además, las biopelículas interactuar con el anfitrión para modular la expresión de numerosos caminos e iniciar la inflamación. Si bien los métodos de alto rendimiento, tales como el ensayo de cristal violeta estándar, puede proporcionar alguna información con respecto al proceso de biopelícula, la visualización de la biopelícula en respuesta a estos factores proporcionan más información en profundidad.

En este manuscrito se describe un método para el uso de factores de el esputo de pacientes con FQ para estudiar el desarrollo de biopelículas in vitro. Este método permite una rápida visualización de biofilms expuestos a esputo que contiene factores del huésped utilizando un kit de biofilm viabilidad comercial. Esta técnica se puede utilizar para identificar visualmente los cambios que ocurren durante el crecimiento de biopelículas en presencia de exógenonos productos, y representa un método mejorado para analizar los cambios en el desarrollo de biopelículas en diversas condiciones.

Protocol

Tenga en cuenta que se requiere Junta Ética de Investigación (REB) para recoger y almacenar muestras de esputo de sujetos humanos. Estos estudios fueron aprobados por el Hospital para Niños Enfermos REB # 1000019444. 1. Preparación de muestras de esputo CF Recoger muestra de esputo de los pacientes durante las visitas rutinarias a la clínica de la fibrosis quística y mantener en hielo. El transporte de la muestra de esputo en el hielo en la primera hora de la recog…

Representative Results

El diseño general del experimento está representado en la Figura 1. El uso de este protocolo proporciona un método conveniente para visualizar los cambios en las biopelículas que crecen durante diferentes períodos de tiempo (por ejemplo, 24, 48 o 72 hr). Es importante destacar que las señales exógenas, tales como esputo filtrados, se puede añadir a visualizar los cambios en el desarrollo de biopelículas. Como se ve en la Figura 2, la pr…

Discussion

Los métodos descritos en este documento permiten la visualización de las biopelículas bacterianas cultivadas en la presencia de productos exógenos. No es sorprendente que la producción de los exoproductos es de importancia cuando se utiliza este tipo de sistema. Por ejemplo, ditiotreitol (DTT), se utiliza a menudo en muestras de esputo humanos para ayudar a licuar las muestras. Sin embargo, el efecto de la TDT solo puede disminuir el desarrollo de biopelículas y la viabilidad (datos no mostrados). Por lo tanto, lo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

TB reconoce una beca de investigación de la fibrosis quística Canadá.

Materials

Lab-Tek II Chambered coverglass, #1.5 borosilicate, 8-well Thermo Sicher Scientific 155409
Filmtracer Live/Dead Biofilm Viabilty Kit Thermo Fisher Scientific L10316
Blood agar plates Thermo Fisher Scientific R10215 Confirming viability via CFU counts or selecting colonies for innoculation
COMSTAT Availble software online COMSTAT is software to analyze biofilm images. Available www.comstat.dk 
Millers LB Broth Thermo Fisher Scientific 12780-052 Standard media for overnight gowth/biofilm growth
Millex-GV Syringe Filters Millipore SLGV013SL Filtering of sputum supernants
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A) Oxoid BR0014G Washing of biofilm chambers after media removal
Zeiss AxioVert 200M Carl Zeiss
Hamamatsu C9100-13 EM-CCD QS Technologies Inc.
Spectral Borealis Qs Technologies Inc.
Perkin Elmer Volocity QS Technologies Inc. Instructions for this software can be found at: http://cellularimaging.perkinelmer.com/pdfs/manuals/VolocityuserGuide.pdf

References

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Cite This Article
Beaudoin, T., Kennedy, S., Yau, Y., Waters, V. Visualizing the Effects of Sputum on Biofilm Development Using a Chambered Coverglass Model. J. Vis. Exp. (118), e54819, doi:10.3791/54819 (2016).

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