Hier beschreiben wir eine quantitative Proteomik Verfahren die Technik der Silac (SILAC) mit Hilfe der Wirkung von HIV-1-Infektion auf Host exosomalen Proteome zu analysieren. Dieses Protokoll kann leicht an Zellen unter verschiedenen Stress oder Infektionsbedingungen angepasst werden.
Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.
Viele menschliche Erkrankungen, einschließlich Virusinfektionen sind häufig mit ausgeprägten zellulären Prozessen verbunden, die stattfinden und um in den betroffenen Zellen. Die Proteine, die oft als die ultimative zelluläre Effektoren wirken, diese Prozesse vermitteln. Die Analyse der Proteine können oft wertvolle Informationen über die lokale Umgebung der betroffenen Zellen liefern und uns helfen, die zugrunde liegenden Mechanismus der Pathogenese der Erkrankung zu verstehen. Unter den verschiedenen Techniken der Proteinanalytik, hält Proteomik besonders vielversprechend. Als leistungsstarker, groß angelegte Tool können Proteomik ein systemisches Verständnis zellulärer Prozesse schaffen, vor allem im Bereich der Funktion und Interaktion von Proteinen. spezifische Proteine zu analysieren ist einfacher durch die Entwicklung von Markierungstechniken hergestellt, die Forscher ermöglichen, die Expression von zellulären Komponenten zu überwachen, insbesondere Proteine, in den Ort der Untersuchung. Obwohl viele Proteom-Analysen wurden auf zellulärer durchgeführt worden istProteom – Skala, Proteomik Charakterisierungen auf subzellulärer Kompartimente haben sich als besonders informativ 1 zu sein. Dies wird beispielhaft auch in den Studien von HIV-1-Infektion.
Exosomen, 30-100 nm Membranvesikel von einer Vielzahl von Zelltypen sekretiert 2, 3, sind kritische Komponenten der interzellulären Kommunikation und molekularen Transport. Sie waren zuvor eine wichtige Rolle bei der HIV-1 – Knospungsvorgang 4, 5 zu spielen entdeckt. Durch die Proteomanalyse mit funktionellen Dissektion kombiniert, fanden wir , dass von HIV-1 – infizierten Zellen freigesetzt Exosomen bestehen aus einer einzigartigen und quantitativ unterschiedliche Proteinsignatur und Hafen regulatorische Moleküle , die auf benachbarten empfänglichen Zellen zelluläre Eigenschaften beeinflussen, einschließlich der zellulären Apoptose und Proliferation 6. Die Verfahren werden in diesem Protokoll beschrieben ist,nämlich SILAC (Silac) 7 basierend proteomic Charakterisierung von Exosomen aus HIV-1 – infizierten Zellen. Ähnliche Ansätze können durch Einstellen der experimentellen Spannung auf den bestimmten Kompartiment oder einen Bruchteil von Interesse und die erforderlichen Änderungen an den beschriebenen Verfahren besser verstehen zu anderen subzellulären Kompartimenten während der Pathogenese angewendet werden.
In Anbetracht der jüngsten Entwicklung von quantitativen Proteomik Methoden gibt es viele zur Auswahl, wenn die effizienteste Methode für ein bestimmtes Experiment ausgewählt. Unter diesen sind die chemisch-basierte iTRAQ (isobar Tags für relative und absolute Quantifizierung) 8 und die markierungsfreie MRM (multiple reaction monitoring) 9 Techniken. Beide Methoden sind leistungsfähige Werkzeuge und sind eine gute Wahl für spezifische Einstellungen. Für eine typische Labor hauptsächlich mit Zelllinien arbeiten, jedoch sind diese beiden Methoden relatively höheren Kosten und sind zeitaufwendig, wenn sie der SILAC basierte Methode verglichen. SILAC ist eine Stoffwechsel basierten Markierungstechnik, die Formen der Aminosäuren aus dem Kulturmedium in zelluläre Proteine nicht-radioaktiven Isotopen enthält. Typischerweise beginnen, SILAC Experimente mit zwei Zellpopulationen, beispielsweise infizierte und nicht infizierte. Jedes Zimmer ist unterschiedlich in seiner spezifischen Isotopen Umgebung markiert bis zur vollständigen Kennzeichnung erreicht wird. Die markierten Exosomen dieser Zellen werden dann an die Proteinextraktion unterzogen. Sobald extrahiert, werden die markierten exosomalen Proteine analysiert Flüssigchromatographie Tandem – Massenspektroskopie 10. Schließlich werden die Ergebnisse der Massenspektrometrie und deutlich markierten Proteine zu statistischen unterworfen und Bioinformatik-Analysen sowie strenge biochemische Überprüfung. Unsere bisherigen Untersuchungsberichte deuten darauf hin, dass die SILAC / exosome Verfahren besser geeignet sind für Zelllinien als primäre Zellen, wie Zelllinien sind in der Regel in einaktiv proliferierenden Zustand für eine effiziente Isotopenmarkierung,
In den in diesem Dokument beschrieben, haben wir gezeigt, die Anwendung der SILAC Technik, um die Wirkung von HIV-1-Infektion auf dem Host exosomalen Proteom zu untersuchen. Anfänglich nicht infizierten und HIV-1-infizierten Zellen sind unterschiedlich isotopenmarkierten. Die differentiell markierten Exosomen werden dann gereinigt, bevor die Proteinextraktion durchgeführt wird. Als nächstes wird die Massenspektrometrie-Flüssigchromatographie-Tandem eingesetzt, um die exosomalen Proteom zu analysieren. Schließlich w…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von einer ARRA Ergänzung zur Lebensdauer / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693 und K24HD080539 BR unterstützt. Diese Arbeit wurde auch von Lifespan Pilot Research Fund (# 701- 5857), Rhode Island Foundation Medical Research Grant (# 20133969), und NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) bis ML unterstützt. Wir danken James Myall und Vy Dang für die Hilfe bei der Handschrift und Figur Vorbereitung.
H9 cell line | ATCC | HTB-176 | |
Trypan Blue | Thermo Fisher | 15250061 | |
MTT assay kit | Thermo Fisher | V13154 | |
Dialyzed fetal bovine serum (FBS) | Thermo Fisher | 26400044 | |
SILAC Protein Quantitation Kit – RPMI 1640 | Thermo Fisher | 89982 | DMEM version (89983) |
L-Arginine-HCl, 13C6, 15N4 for SILAC | Thermo Fisher | 88434 | |
L-Lysine-2HCl, 13C6 for SILAC | Thermo Fisher | 88431 | |
HIV-1NL4-3 | NIH AIDS Reagent Program | 2480 | |
Alliance HIV-1 p24 Antigen ELISA kit | PerkinElmer | NEK050001KT | |
Refrigerated super-speed centrifuge | Eppendorf | 22628045 | |
Refrigerated ultracentrifuge | Beckman Coulter | 363118 | Should be able to reach 100,000g |
50mL Conical Centrifuge Tubes | Thermo Fisher | 14-432-22 | |
Ultracentrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
SW 32 Ti Rotor | Beckman Coulter | 369694 | |
RIPA buffer | Thermo Fisher | 89900 | |
Protease Inhibitor Cocktails | Thermo Fisher | 78430 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5384000020 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher | 23250 | |
Spectrophotometer | Biorad | 1702525 | |
SDS PAGE Gel apparatus | Thermo Fisher | EI0001 | |
Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gels | Novex | XV04200PK20 | |
Gel staining reagent | Sigma Aldrich | G1041 | |
Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5111 | |
SpeedVac Concentrator | Thermo Fisher | SPD131DDA | |
Antibody to human annexin A5 | Abcam | ab14196 | |
Antibody to human lactate dehydrogenase B chain | Abcam | ab53292 | |
Graphing and Statistical Software | Systat | SigmaPlot | Or GraphPad Prism |
Quantitative proteomics software suite | Max Planck Institue of Biochemistry | Maxquant | |
Software and databases | Various vendors | Refer to main text for details |