Summary

زيكا الفيروسات نظام المعدية خلية الثقافة و<em> في المختبر</em> وقائية تأثير الانترفيرونات

Published: August 23, 2016
doi:

Summary

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Abstract

زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض الناشئة التي يرتبط تشوهات النمو الجنين مثل صغر الرأس، وعيوب العين، وإعاقة النمو. ZIKV هو فيروس RNA من عائلة الفيروسات المصفرة. ينتقل ZIKV أساسا عن طريق البعوض، ولكن يمكن أيضا أن ينتشر عن طريق الأم إلى الجنين انتقال العدوى فضلا عن الاتصال الجنسي. حتى الآن، هناك أي علاج أو لقاح خيارات الموثوقة المتاحة لحماية المصابين بالفيروس. تطوير نظام استنساخه وفعال زيكا الفيروسات المعدية زراعة الخلايا أمر بالغ الأهمية لدراسة الآليات الجزيئية من تكرار ZIKV وكذلك الأدوية واللقاحات التنمية. وفي هذا الصدد، يتم الإبلاغ عن بروتوكول يصف في المختبر زيكا نظام الثدييات خلية القاعدة ثقافة الفيروس لتحليل الإنتاج والنمو الفيروسي هنا. يتم عرض تفاصيل عن تشكيل لويحات فيروس زيكا على أحادي الطبقة الخلية وفحص اللوحة لقياس عيار الفيروسية. حركية تكرار الجينوم الفيروسيويتم تحديد المزدوج تقطعت بهم السبل وسيطة replicatory RNA الجينوم. وقد استخدمت هذه المنصة الثقافة إلى الشاشة ضد مكتبة من مجموعة صغيرة من السيتوكينات مما أدى إلى تحديد الإنترفيرون α (IFN-α)، IFN-β وIFN-γ باسم مثبطات قوية من النمو الفيروسي زيكا. وخلاصة القول إن أظهرت وجود نظام في المختبر المعدية زيكا الفيروسي الثقافة ومختلف فحوصات الفيروسية في هذه الدراسة، والتي لديها القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية في توضيح مزيد من الآليات المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية. فيروسات الإنترفيرون ألفا يمكن إجراء مزيد من التقييم باعتباره، بعد التعرض للقائي، وخيار العلاج الوقائي للعدوى فيروس زيكا في السكان المعرضة للخطر، بما في ذلك النساء الحوامل المصابات.

Introduction

زيكا فيروس (ZIKV) هو الممرض البشري المهم المرتبط صغر الرأس وضعف الحمل أدائهن 1،4. ZIKV ينتمي إلى مجموعة من flaviviruses ذات الصلة طبيا يمكن أن يسبب تشوهات عصبية مثل حمى الضنك وغرب النيل، والفيروسات التهاب الدماغ سانت لويس. الوسيلة الرئيسية لانتقال الفيروس هو من البعوض الناقل الزاعجة المصرية، وبالإضافة إلى ذلك، كما تم الإبلاغ عن الأمراض المنقولة جنسيا 5،6. أصبح ZIKV مشكلة صحية عالمية رئيسية بسبب التوزيع الجغرافي التوسع من البعوض الناقل للمرض وعلاقة قوية مع تشوهات خلقية. تم عزل ZIKV أولا في عام 1947 من قرد هندي صغير خفيرا في الغابة زيكا، أفيد أوغندا وأول حالة بشرية في عام 1952 7،8. الأفراد الذين يصابون بعدوى ZIKV الحاضر مع أعراض خفيفة مثل الحمى والطفح الجلدي، والصداع، والتهاب الملتحمة، والعضلات / آلام المفاصل. النساء الحوامل المصابات يمكن أن تنقل ZIKV إلى الجنين 1. Zكما تم ربط الإصابة IKV لمتلازمة غيلان باريه، والأعصاب الطرفية اضطراب المناعة الذاتية إزالة الميالين 9.

يتكون الجينوم الفيروسي زيكا من الشعور الإيجابي، جزيء RNA واحد الذين تقطعت بهم السبل وهي عبارة عن 10.8 kilobases في الطول. ويتم تنظيم بنية الجينوم كما 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR، مع المناطق غير المشفرة (NCR) المرافقة منطقة ترميز البروتين 6. وترجم polyprotein واحد (3419 أأ) التي هي المشارك والمشقوق بعد translationally إلى 10 الببتيدات الصغيرة. كل من 5'NCR و3'NCR RNA الهياكل الجذعية حلقة تلعب دورا حاسما في بدء الجينوم ترجمة الفيروسية والتكرار. وتتألف المكونات الهيكلية للجينوم البروتينات قفيصة، غشاء، والمغلف. البروتينات غير الهيكلية حاسمة للنسخ المتماثل الجينوم.

حاليا، يتم تجميع زيكا السلالات الفيروسية إلى ثلاثة أنماط جينية رئيسية هي: غرب أفريقيا، شرق أفريقيا، وآسيا 6،10-13. وقد اقترح أن النسب شرق أفريقيا امتدت إلى غرب أفريقيا وآسيا، حيث أنه في وقت لاحق مزيد من تطور 12. وراثى الآسيوي هو المسؤول عن تفشي الحالية في الأمريكتين. زيكا الفيروس يمكن أن يكون مثقف في كل من البعوض وخلايا الثدييات. الخلايا الليفية الأولية عن طريق الجلد، والخلايا الجذعية غير الناضجة، والخلايا العصبية السلف القشرية، وخلايا فيرو عرضة للزيكا عدوى فيروسية 10،14،15. وقد أظهرت كل من النوع الأول والنوع الثاني إنترفيرون لتقييد نمو ZIKV في الخلايا الليفية الجلد 15. أهداف هذه الدراسة إلى تقديم، بروتوكول تدريجي مفصل لإنتاج ويعاير من النمط الجيني الآسيوية ZIKA السلالة الفيروسية PRVABC59 في نظام زراعة الخلايا الثديية وبيان فائدة هذا النظام الثقافة المعدية كمنصة تطوير العقاقير. هذا المورد لديه القدرة على الاستفادة بشكل كبير من الأوساط البحثية الفيروسي والعصبية زيكا لزيادة توضيح طآليات TS المرضية الفيروسية وتطور الفوعة الفيروسية.

Protocol

ملاحظة: ويرد ملخص تخطيطي لتدفق العمل في الشكل 1. 1. الخلايا استخدام خلايا فيرو لإنتاج فيروس زيكا وتحليل دورة تكاثر الفيروس. إعداد وسائل الإعلام …

Representative Results

وقد استخدمت؛ (بنك الجينات عدد الانضمام KU501215 PRVABC59) من النمط الجيني الآسيوية في هذه الدراسة 12 سلالة فيروسية زيكا. واستخدمت خلايا فيرو في 80٪ confluency للتحقيق من جديد زيكا عدوى فيروسية. لإنتاج الفيروسي وتوصيف الفيروسي لاحق، كان يعمل لمرور وقت مب…

Discussion

هنا، يتم تقديم بروتوكول مبسط لزراعة فيروس زيكا في المختبر. الخطوات الحاسمة بما في ذلك تحديد نقاط النهاية المثلى لتوسيع ثقافة الفيروسات، قياس عيار، وقياس تكرار الجينوم قدمت. زيكا الفيروس الممرض البشري، لذلك، في حين أن التعامل مع العوامل المعدية، وإجراءات السلا?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Aaron Brault and Dr. Brandy Russell of the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), USA for providing Zika viral strain PRVABC59. We thank Nicholas Ten of Yale University for copy-editing this manuscript. This work was supported by the Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award to V.A.

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Sigma Life Science D5796
HEPES Life Technologies 15630080
Glutamax Life Technologies 35050061
2.5% Trypsin, 10X [-] Phenol Red   Corning 25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4% Life Technologies T10282
Countess – Automated Cell Counter ThermoFisher Scientific C10227
Countess-cell counting  chamber slides ThermoFisher Scientific C10283
Rneasy Mini Kit Qiagen 74104
Nanodrop 2000 Thermo Scientific Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2  English & Scientific Consulting Kft. 10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594 Life Technologies A11020
SUPERSCRIPT III RT  Life Technologies 18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX Life Technologies 11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System Thermo Fischer 4471088
RNase-Free DNase Promega M6101
Vero Cell Line  ATCC CCL-81
Zika viral strain PRVABC59 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6 Peprotech 200-06             
IL-1 alpha        Peprotech 200-01A          
TNF-alpha Peprotech 300-01A          
Interferon alpha A   R & D Systems 11100-1
Interferon beta Peprotech 300-02BC
Interferon gamma Peprotech 300-02
Centrifuge 5415R Eppendorf 5415R
Centrifuge 5810R Eppendorf 5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI Nikon Visit Nikon for Request

References

  1. Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro – Preliminary Report. N Engl J Med. , 1-11 (2016).
  2. Lucey, D. R., Gostin, L. O. The Emerging Zika Pandemic: Enhancing Preparedness. JAMA. 315 (9), 865-866 (2016).
  3. Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. N Engl J Med. 374 (10), 951-958 (2016).
  4. Schuler-Faccini, L., et al. Possible Association Between Zika Virus Infection and Microcephaly. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 65 (3), 59-62 (2015).
  5. Foy, B. D., et al. Probable non-vector-borne transmission of Zika virus, Colorado, USA. Emerg Infect Dis. 17 (5), 880-882 (2011).
  6. Kuno, G., Chang, G. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol. 152 (4), 687-696 (2007).
  7. Dick, G. W. Zika virus. II. Pathogenicity and physical properties. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 521-534 (1952).
  8. Dick, G. W., Kitchen, S. F., Haddow, A. J. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg. 46 (5), 509-520 (1952).
  9. Oehler, E., et al. Zika virus infection complicated by Guillain-Barre syndrome–case report, French Polynesia. Euro Surveill. 19 (9), 1-3 (2013).
  10. Baronti, C., et al. Complete coding sequence of zika virus from a French polynesia outbreak in 2013. Genome Announc. 2 (3), e00500-e00514 (2014).
  11. Lanciotti, R. S., et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronesia, 2007. Emerg Infect Dis. 14 (8), 1232-1239 (2008).
  12. Lanciotti, R. S., et al. Phylogeny of Zika virus in Western Hemisphere, 2015 [Letter]. Emerg Infect Dis. 22 (5), (2016).
  13. Musso, D., Nilles, E. J., Cao-Lormeau, V. M. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacific area. Clin Microbiol Infect. 20 (10), O595-O596 (2014).
  14. Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. , 1-5 (2016).
  15. Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89 (17), 8880-8896 (2015).
  16. Faye, O., et al. Quantitative real-time PCR detection of Zika virus and evaluation with field-caught mosquitoes. Virol J. 10, 311 (2013).
  17. Chu, D., et al. Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome. J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).
  18. Hiratsuka, M., et al. Administration of interferon-alpha during pregnancy: effects on fetus. J Perinat Med. 28 (5), 372-376 (2000).
  19. Ozaslan, E., et al. Interferon therapy for acute hepatitis C during pregnancy. Ann Pharmacother. 36 (11), 1715-1718 (2002).

Play Video

Cite This Article
Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro Prophylactic Effect of Interferons. J. Vis. Exp. (114), e54767, doi:10.3791/54767 (2016).

View Video