Summary

Dosages pour étudier le rôle de la vitronectine dans adhésion bactérienne et la résistance au sérum

Published: October 16, 2018
doi:

Summary

Ce rapport décrit les protocoles pour caractériser les interactions entre les protéines de membrane externe bactérienne et la vitronectine régulateur de complément humain. Les protocoles peuvent être utilisés pour étudier les réactions de la liaison et la fonction biologique de la vitronectine dans n’importe quelle espèce bactérienne.

Abstract

Bactéries utilisent le complément régulateurs comme un moyen d’échapper à la réponse immunitaire hôte. Nous décrivons ici les protocoles d’évaluation de l’acquisition de vitronectine de rôle aux fois surface de cellule bactérienne dans la résistance pour le système immunitaire. Expériences de cytométrie de flux identifié la vitronectine plasma humain comme ligand pour la protéine de membrane externe du récepteur bactérien H d’Haemophilus influenzae type f. Un dosage immuno-enzymatique a été utilisé pour caractériser les interactions protéine-protéine purifiée de la protéine recombinante H mettant aux prises la vitronectine et affinité a été évaluée en utilisant l’interférométrie bio-couche. L’importance biologique de la liaison de la vitronectine à H la protéine à la surface des cellules bactériennes à l’évasion de la réponse immunitaire hôte a été confirmée à l’aide d’un test de résistance de sérum avec sérum humain normal et appauvri la vitronectine. L’importance de la vitronectine dans l’adhérence bactérienne a été analysée à l’aide de lames de verre, avec ou sans revêtement de vitronectine, suivie par la coloration de Gram. Enfin, l’adhérence bactérienne aux monocouches de cellules épithéliales alvéolaires humains a été étudiée. Les protocoles décrits ici peuvent être facilement adaptés à l’étude de toutes les espèces bactériennes d’intérêt.

Introduction

La vitronectine (Vn) est une glycoprotéine humaine importante impliqués dans le maintien de l’homéostasie par l’intermédiaire de la régularisation du système fibrinolytique. VN fonctionne aussi comme un régulateur de complément en inhibant la voie du complément terminal au cours de la formation d’un complexe C5b6-7 et la polymérisation de C9. Plusieurs bactéries pathogènes ont démontré que recruter Vn à la surface cellulaire comme moyen de résistance complément dépôt1,2,3. En outre, Vn fonctionne comme une molécule « sandwich » entre bactéries et récepteurs des cellules épithéliales hôte, favorisant ainsi l’adhérence et l’internalisation des pathogènes2,4,5. Liaison du Vn à la surface de la cellule bactérienne est véhiculée par d’autres protéines actuellement non identifiés. Élucider pleinement le rôle fonctionnel de Vn-liaison à l’évasion de la réponse immunitaire de tuyau exigera donc identification de protéines Vn-recrutement.

La première étape dans l’identification des protéines liant Vn est pour tester si un agent pathogène d’intérêt peut lier purifiée Vn. cytométrie en flux est une méthode pratique et simple pour déterminer si Vn est lié aux cellules de l’agent pathogène. Dans cette étude, nous avons évalué la liaison du Vn à divers Haemophilus influenzae type f (Hif) isolats cliniques6. La méthode décrite ici est quantitative et peut être utilisée pour distinguer la capacité de liaison d’une grande variété de souches bactériennes. Dans une étude précédente, nous avons caractérisé protéine H (PH) de Hif comme un liant Vn protéine7. Par conséquent, dans la présente étude, le potentiel de liaison Vn de mutants de type sauvage (WT) Hif et Hif M10Δ del/h ont été comparées en utilisant les protocoles décrits.

Lorsqu’il est déterminé qu’un pathogène lie Vn, la deuxième étape est de caractériser la surface proteome afin d’identifier des protéines liant le Vn potentiels. Une variété d’approches peut être utilisée pour ce but8,9, mais ces méthodes ne sont pas décrits dans le présent rapport. La méthode plus appropriée pour l’examen des interactions protéine-protéine est d’inoculation exprimer certaines protéines de surface bactériennes chez e. coli et purification par chromatographie d’affinité. Ici, nous utilisons des PH et ses interactions moléculaires Vn pour illustrer la méthode. Interactions entre recombinant PH et Vn furent caractérisées par une enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)7 et une technique récemment développée d’exempte d’étiquette appelée bio-couche interférométrie (BLI)10,11. Alors que les tests ELISA peuvent servir à confirmer les interactions protéine-protéine, BLI fournit des données détaillées sur les paramètres cinétiques des interactions.

Afin d’étudier le rôle fonctionnel de Vn en adhérence bactérienne, deux dosages différents peuvent être utilisés. Le premier test décrit ici est une mesure directe de l’adhérence des bactéries sur des surfaces de verre enduit de Vn, tandis que le deuxième test examine l’adhérence à la surface des cellules épithéliales. Pour le premier test, lames de verre ont été revêtus de Vn, et la liaison du WT ou souches mutantes de Hif a été évaluée par microscopie et coloration de Gram. Cette technique permet de distinguer facilement bactéries basés sur la capacité de lier Vn12. Adhérence bactérienne aux cellules de mammifères a été analysée puis en ajoutant des bactéries cultivées sur une monocouche de cellules épithéliales alvéolaires de la type II ; attachement des bactéries a été évaluée en comptant le nombre de formatrices unités (UFC). Collés et intériorisées de bactéries peuvent être distinguées en présence ou en absence de Vn4,13.

Le rôle de l’acquisition de Vn en résistance au sérum bactérienne a été évalué par dosage sérique meurtre (c’est-à-dire, l’activité bactéricide de sérum). Afin d’évaluer l’importance de l’acquisition de Vn dans la résistance au sérum, l’activité bactéricide du sérum appauvris en Vn (VDS) a été comparée à celle du sérum humain normal (NHS). La méthode utilisée facilement distingue liant Vn contre bactéries non contraignant basés sur la résistance au sérum. Nous avons utilisé cette méthode pour étudier le rôle de Vn dans la résistance au sérum de plusieurs bactéries pathogènes4,12.

De nombreuses méthodes ont été rapportés pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Nous décrivons ici un ensemble de protocoles qui peuvent être facilement adaptés à l’étude de tout agent pathogène afin d’évaluer le rôle de Vn dans la pathogenèse. Nous avons testé ces protocoles à l’aide de différents agents pathogènes, et Hif a été choisi comme exemple pour ce rapport.

Protocol

1. analyse des Vn comme Ligand protéine bactérienne de Surface Détection de Vn-fixation à la surface bactérienne à l’aide de cytométrie en fluxRemarque : En cytométrie en flux, nous avons utilisé diffusion latérale et forward scatter pour porte des événements positifs. Pour examiner les interactions avec les Vn, Hif clinique isole (n = 10)7 ont été sélectionnés ainsi qu’e. coli BL21 (DE3) comme témoin négatif (Fig…

Representative Results

VN-fixation à la surface des bactéries a été déterminée par cytométrie en flux. Hif tous les isolats cliniques testés dans cette étude a recruté Vn à la surface des cellules. Aucune interaction de Vn avec la surface cellulaire a été observée pour la souche de contrôle négatif d’e. coli (Figure 1A). Comme illustré à la Figure 1B, le PH est une protéine liant Vn majeur…

Discussion

Bactéries pathogènes recrutent Vn à la surface des cellules et d’utilisent ce régulateur de complément pour éviter les dépôts de facteurs du complément et l’achèvement du complexe membranaire attaque2. VN fonctionne aussi comme une molécule de pont entre les protéines de surface bactériennes et de récepteurs de surface cellulaire hôte, permettant ainsi des agents pathogènes d’adhérer à la surface des cellules épithéliales et par la suite servir de médiateur internalisati…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation d’Anna et Edwin Berger, Lars Hierta, O.E. et Edla Johansson Foundation, le Swedish Medical Research Council (accorder numéro K2015-57 X-03163-43-4, www.vr.se), la Fondation du Cancer à l’Université Hôpital de Malmö, la société physiographiques (de Forssman Fondation) et du Conseil de comté de Skåne Research and Development Foundation.

Materials

1.5 mL thermomixter Eppendorf 5355 dry block heating and cooling shaker
5 mL polystyrene round-bottom tube  BD Falcon 60819-138 12 × 75 mm style
5% CO2 supplied incubator  Thermo Scientific  BBD6220
6 mL polystyrene round-bottom tube  VWR 89000-478 12 × 75 mm style with cap
24-well plates BD Falcon 08-772-1H Cell culture grade
30% Hydrogen peroxide (H2O2) solution Sigma-Aldrich H1009-100ML Laboratory analysis grade
75 cm2 tissue culture flask BD Falcon BD353136 Vented
96 well black flat bottom plate Greiner Bio-One 655090 Tissue culture treated µClear black plates
A549 Cell Line human Sigma-Aldrich 86012804-1VL
Cell detachment enzyme (Accutase)  Sigma-Aldrich A6964-500ML Cell Culture Grade
AR2G sensors Pall Life Science 18-5095 Sensor to immobilized protein by amino coupling 
Acetone VWR 97064-786 Analysis grade
Bovine Serum Albumins (BSA) Sigma-Aldrich A2058 Suitable for cell culture
Bibulous paper  VWR 28511-007
Bio-layer interferometer Pall Life Science FB-50258 Bilayer interferometry measuring equipment
Crystal violet solution Sigma-Aldrich HT90132-1L
C4BP (C4b binding protein) Complement Technology, Inc. A109 Bought as Frozen liquid form
Calcium chloride (CaCl2) Sigma-Aldrich C5670-500G
Carbol-fuchsin solution Sigma-Aldrich HT8018-250ML
Citric acid Sigma-Aldrich 251275-500G American Chemical Society (ACS) grade
Decolorizing solution Sigma-Aldrich 75482-250ML-F
E. coli host (E. Coli BL21) Novagen 69450-3 Protein expression host
F12 medium Sigma-Aldrich D6421 Cell Culture Grade
Flow cytometer  BD Biosciences 651154 Cell analysis grade for research applications 
Fetal Calf Serum (FCS) Sigma-Aldrich 12003C Suitable for cell culture
Normal human serum (NHS) Complement Technology, Inc. NHS Pooled human serum
FITC-conjugated donkey anti-sheep antibodies  AbD Serotec STAR88F Polyclonal
Gentamicin Sigma-Aldrich G1397 Cell culture grade
Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
Gelatin Sigma-Aldrich G9391 Suitable for cell culture
Hemocytometer Marienfeld 640210
HRP-conjugated anti-His tag antibodies Abcam ab1269 Polyclonal
Human factor H Complement Technology, Inc. A137 Bought as Frozen liquid form
C4BP Complement Technology, Inc. A109 Frozen solution
Human serum albumin Sigma-Aldrich A1653-10G lyophilized powder
Histidine affinity resin column (HisTrap HP) GE Health Care Life Science 17-5247-01 Columns prepacked with Ni Sepharose
His-tagged PH Recombinantly expressed and purified in our lab
Iodine solution Sigma-Aldrich HT902-8FOZ
Methanol VWR BDH1135-1LP Analysis grade
 Microscope Olympus IX73 Inverted microscope
Microscope slides Sigma-Aldrich S8902 plain, size 25 mm × 75 mm 
Magnesium chloride (MgCl2) Sigma-Aldrich M8266-1KG
Plasmid containg C terminal 6x His-tag on the backbone (pET26(b)) Novagen 69862-3 DNA vector
Polysorb microtitre plates  Sigma-Aldrich M9410 For ELISA
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich 6009 American Chemical Society (ACS) grade
Sheep anti-human Vn antibodies AbD Serotec AHP396 Polyclonal
Shaker  Stuart Scientific STR6 Platform shaker
Tissue culture flask BD Falcon 3175167 75 cm2
 Thermomixer  Sigma-Aldrich T3317 Dry block heating and cooling shaker
Tetramethylbenzidine Sigma-Aldrich 860336-100MG ELISA grade
Vitronectin (Vn) from human plasma Sigma-Aldrich V8379-50UG cell culture grade

References

  1. Singh, B., Su, Y. C., Riesbeck, K. Vitronectin in bacterial pathogenesis: a host protein used in complement escape and cellular invasion. Mol. Microbiol. 78 (3), 545-560 (2010).
  2. Hallstrom, T., et al. Conserved Patterns of Microbial Immune Escape: Pathogenic Microbes of Diverse Origin Target the Human Terminal Complement Inhibitor Vitronectin via a Single Common Motif. PloS one. 11 (1), 0147709 (2016).
  3. Su, Y. C., Hallstrom, B. M., Bernhard, S., Singh, B., Riesbeck, K. Impact of sequence diversity in the Moraxella catarrhalis. UspA2/UspA2H head domain on vitronectin binding and antigenic variation. Micro. Infect. 15 (5), 375-387 (2013).
  4. Singh, B., et al. A fine-tuned interaction between trimeric autotransporter haemophilus surface fibrils and vitronectin leads to serum resistance and adherence to respiratory epithelial cells. Infect. Immun. 82 (6), 2378-2389 (2014).
  5. Kohler, S., et al. Binding of vitronectin and Factor H to Hic contributes to immune evasion of Streptococcus pneumoniae. serotype 3. Thromb. haemostasis. 113 (1), 125-142 (2015).
  6. Onelli, E., Citterio, S., O’Connor, J. E., Levi, M., Sgorbati, S. Flow cytometry, sorting and immunocharacterization with proliferating cell nuclear antigen of cycling and non-cycling cells in synchronized pea root tips. Planta. 202 (2), 188-195 (1997).
  7. Al-Jubair, T., et al. Haemophilus influenzae Type f Hijacks Vitronectin Using Protein H To Resist Host Innate Immunity and Adhere to Pulmonary Epithelial Cells. J. Immunol. 195 (12), 5688-5695 (2015).
  8. Martinez-Martin, N. Technologies for Proteome-Wide Discovery of Extracellular Host-Pathogen Interactions. J. Immunol. Res. 2017, 2197615 (2017).
  9. Boleij, A., Laarakkers, C. M., Gloerich, J., Swinkels, D. W., Tjalsma, H. Surface-affinity profiling to identify host-pathogen interactions. Infect. Immun. 79 (12), 4777-4783 (2011).
  10. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  11. Sultana, A., Lee, J. E. Measuring protein-protein and protein-nucleic Acid interactions by biolayer interferometry. Cur. Prot. Prot. Sc. 79, 11-26 (2015).
  12. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae acquires vitronectin via the ubiquitous Protein F to subvert host innate immunity. Mol. Microbiol. 87 (6), 1245-1266 (2013).
  13. Ronander, E., et al. Nontypeable Haemophilus influenzae adhesin protein E: characterization and biological activity. J. Infect. Dis. 199 (4), 522-531 (2009).
  14. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D’Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bact. 189 (23), 8746-8749 (2007).
  15. Fleury, C., et al. Identification of a Haemophilus influenzae factor H-Binding lipoprotein involved in serum resistance. J. Imunol. 192 (12), 5913-5923 (2014).
  16. Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).
  17. Rich, R. L., Myszka, D. G. Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis. Anal. Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).
  18. McNamara, G., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Microscopy and image analysis. Current protoc. Hum. Genet. , 4 (2005).
  19. Lieber, M., Smith, B., Szakal, A., Nelson-Rees, W., Todaro, G. A continuous tumor-cell line from a human lung carcinoma with properties of type II alveolar epithelial cells. International J. Canc. 17 (1), 62-70 (1976).
  20. Foster, K. A., Oster, C. G., Mayer, M. M., Avery, M. L., Audus, K. L. Characterization of the A549 cell line as a type II pulmonary epithelial cell model for drug metabolism. Exp. Cell Res. 243 (2), 359-366 (1998).
  21. Su, Y. C., et al. Haemophilus influenzae P4 Interacts With Extracellular Matrix Proteins Promoting Adhesion and Serum Resistance. J. Infect. Dis. 213 (2), 314-323 (2016).
  22. Singh, B., Al-Jubair, T., Morgelin, M., Thunnissen, M. M., Riesbeck, K. The unique structure of Haemophilus influenzae protein E reveals multiple binding sites for host factors. Infect. Immun. 81 (3), 801-814 (2013).
  23. Vellaiswamy, M., Campagna, B., Raoult, D. Transmission electron microscopy as a tool for exploring bacterial proteins: model of RickA in Rickettsia conorii. New Microbiolog. 34 (2), 209-218 (2011).
  24. Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence assay of leptospiral surface-exposed proteins. J. Vis. Exp. JoVE. (53), (2011).

Play Video

Cite This Article
Singh, B., Mostajeran, M., Su, Y., Al-Jubair, T., Riesbeck, K. Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance. J. Vis. Exp. (140), e54653, doi:10.3791/54653 (2018).

View Video