Estudio in vivo de Interacción Humano-endotelial de pericitos Utilización de Plug Ensayo matriz de gel en el ratón

Summary

Se presenta un protocolo para estudiar las interacciones del endotelio de pericitos humanos en ratón usando una variación del ensayo de angiogénesis tapón de gel de matriz.

Abstract

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

Introduction

La angiogénesis es el proceso por el que los nuevos vasos sanguíneos se forman a partir de una red vascular preexistente ¹ y es el foco de la investigación en curso a través de muchas áreas que van desde el desarrollo normal a la enfermedad. Este proceso dinámico implica la proliferación y migración de células endoteliales (EC) y el reclutamiento de pericitos para la construcción de un tubo vascular que se dirige hacia el sitio que necesita oxígeno y nutrientes ^2. Para estudiar este proceso requiere un ensayo igualmente dinámico, lo más importante que puede recapitular la naturaleza tridimensional de la formación del tubo. Los ensayos in vitro de la matriz 3D se han desarrollado para hacer frente a esta necesidad y han funcionado bien para permitir que los investigadores definir los pasos discretos en el espacio y el tiempo en el que tiene lugar la angiogénesis ^{3, 4, 5, 6.} Sin embargo, estos modelos matriciales en 3D in vitro se limitan a estudiar los vasos no perfundidos unad por lo tanto, carecen de los componentes críticos pertinentes para el proceso de angiogénesis (por ejemplo, haciendo circular el crecimiento y factores inhibidores, la tensión antinatural / fuerzas a través del lecho vascular) y dejar de simular el complejo entorno presente en el tejido vivo. Para hacer frente a esta limitación, varios ensayos de angiogénesis in vivo se han desarrollado ^7, incluyendo el ensayo de tapón de gel de matriz que será el tema central de nuestro informe ^{8, 9.}

El ensayo de tapón de gel de matriz es un ensayo de angiogénesis in vivo bien establecido que atrae a los investigadores, ya que proporciona una plataforma sólida para probar las funciones de las diferentes células y sustancias en la angiogénesis. gel Matrix es una solución de membrana basal disponibles en el mercado que es secretada por la línea celular de sarcoma de ratón de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) que se solidifica en un material similar a un gel a 37 ° C. El gel de matriz puede mezclarse con células y / o sustancias, tales como factores de crecimiento, y injected por vía subcutánea en el ratón. El anfitrión EC invadirá el tapón de más de 14 días, formar una red vascular, y se convierten en perfusión de la sangre del huésped. Hasta la fecha, los ensayos tapón de gel de matriz se han centrado exclusivamente en el estudio del comportamiento de las células endoteliales durante la angiogénesis, sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento todavía no se ha hecho ningún esfuerzo para determinar si este ensayo puede usarse células endoteliales de co-cultivo y pericitos para estudiar cómo interactúan estos dos tipos de células durante la angiogénesis. Específicamente, la comprensión de la relación entre la EC y pericitos es valioso para el estudio de enfermedades en las que la pérdida de vasos sanguíneos es patológica, incluyendo isquemia microvascular y enfermedad vascular periférica ^{10, 11, 12.}

A continuación, se describe un protocolo que introduce pericitos derivadas de seres humanos a la mezcla de gel de la matriz junto con EC humana y el factor de crecimiento de fibroblastos (bFGF). Esta mezcla luego se puede inyectar por vía subcutánea in el dorso de ratones SCID para permitir la formación de vasos híbridos, totalmente funcionales, con recubrimiento de pericitos. Nuestro protocolo se describe cómo preparar tapones de gel de matriz que contienen EC humanos, ya sea con o sin pericitos humanos, la colocación en ratones SCID y cómo analizar los cortes histológicos de los puntos finales de la angiogénesis críticos.

Protocol

Declaración de Ética: Los procedimientos que implican sujetos animales han sido aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo de la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford. NOTA: Los animales están bajo anestesia con isoflurano al 3% vaporizador y suministro de 3% de gas O2. El uso de ungüento veterinario en los ojos puede ayudar a prevenir la sequedad, mientras que bajo anestesia. 1. Preparación de la célula Crecer cultivos de células endoteliales…

Representative Results

Representante tinción H & E y de inmunofluorescencia de secciones tapón de gel de la matriz se muestran en la Figura 2. Secciones de la CE únicamente las clavijas muestran algunos vasos que en su mayoría no son perfundidos con sangre (Figura 2 arriba a la izquierda, flechas negras), mientras que los tapones que contienen tanto las EC y los pericitos mostrar varios perfundidos vasos de mayor diámetro y la cobertura de pericitos completa, como se …

Discussion

El ensayo de tapón de gel de matriz ha demostrado ser un método conveniente y potente para evaluar la regulación de genes en la angiogénesis, los compuestos angiogénicos y antiangiogénicos en vivo, y como complemento a las pruebas in vitro. A continuación, describimos en detalle un nuevo ensayo tapón de gel de la matriz de la angiogénesis humana que investiga la interacción entre las células endoteliales y pericitos durante la formación de los vasos.

Ha…

Materials

PBS (Phosphate buffered saline)	Corning	21-031-CV
0.25% Trypsin/0.53mM EDTA	Corning	25-053-CI
Endothelial Cell Media (ECM) kit	Sciencell	1001	includes media, EC growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
Pericyte Media (PM) kit	Sciencell	1201	includes media, Pericyte growth supplement, and penicillin/streptomycin, each supplied at the appropriate volume for easy mixing
primary human pulmonary microvascular endothelial cells	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is also available commercially. Cells used at passage 1-4
primary human pulmonary pericytes	Pulmonary Hypertension Breakthrough Initiative		this cell type is not available commercially, but brain paricytes are.  Cells used at passage 1-4
bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)	Peprotech	100-18B	stock solution is 50ug/ml in 0.1% BSA in PBS, aliquots at 50 uL and stored at -20 degrees
Matrigel Basement Membrane Matrix	BD	356237
28G 1cc Insluin Syringe	BD	329410
SCID (Severe Combined Immune Deficiency) mice	The Jackson Laboratory	5557	NOD.SCID IL2R gamma knockout strain is the best strain; 4-6 weeks of age
1.5mL microcentrifuge tubes, sterile	Thermo Fisher Scientific	05-408-129
15 mL screw top tubes, sterile	BD Biosciences	352096
PAP pen	Life Technologies	8899
hemocytometer	ThermoFisher Scientific	02-671-6
Nair hair removal cream	Walmart
anti-human CD31 primary antibody	LifeSpan Biosciences	LS-B4737	working solution is 1:50
anti-human Smooth Muscle actin CY3 primary fluorescent antibody	Sigma	C6198	working solution is 1:300
goat anti-rabbit secondary antibody; 488/green	ThermoFisher Scientific	A-11008	working solution is 1:250
Prolong Gold DAPI solution	Cell Signaling	8961S
microscope slides	VWR	48300-047
no. 1.5 cover slips	Thermo Fisher Scientific	12-544-D
citrate buffer 10x	Millipore	21545
extra fine surgical scissors	Fine Science Tools	14084-08
Formalin (paraformaldehyde)	Thermo Fisher Scientific	245-685
Tissue cassettes	Simport	M492-12
goat serum	Dako	X0907