Preparación de CD4<sup> +</sup> Las células T para el Análisis de GD3 y GD2 gangliósidos membrana Expresión mediante microscopía
Summary
Se describe un protocolo de tinción estándar de anticuerpos para su uso en la microscopía para determinar la expresión en la membrana y la localización de los gangliósidos en reposo y células T CD4 + vírgenes humanos activados. También se describen en tiempo real PCR experimentos usando <40.000 células que no requieren kits adicionales bajos de ARN de entrada.
Abstract
Los métodos aquí descritos para la activación de las células T CD4 + no tratados previamente en suspensión y su adhesión en cubreobjetos para el análisis de microscopía confocal permiten la localización espacial y la visualización de los gangliósidos que participan en la activación de células T CD4 +, que la expresión complemento experimentos de perfiles tales como citometría de flujo, en el oeste Blot o PCR en tiempo real. La cuantificación de la expresión de gangliósidos a través de citometría de flujo y su localización celular a través de microscopía se puede obtener por el uso de anticuerpos anti-gangliósido con alta afinidad y especificidad. Sin embargo, un manejo adecuado de células en suspensión implica el tratamiento de placas de cultivo para promover la adherencia necesaria requerida para la fluorescencia o la adquisición microscopía confocal. En este trabajo, se describe un protocolo para determinar GD3 y GD2 expresión de gangliósidos y colocalización con el TCR durante la activación de ingenuo células T CD4 +. También, en tiempo real, texperimentos ime PCR usando <40.000 células se describen para la determinación de la GD3 y GM2 genes / GD2 sintasa, lo que demuestra que los experimentos de análisis de gen se puede realizar con un bajo número de células y sin la necesidad de kits adicionales bajos de ARN de entrada.
Introduction
Las células T CD4 + orquestan la respuesta inmune a través de sus funciones efectoras después de la activación por las células presentadoras de antígeno 1. El estudio de los mecanismos celulares que están moduladas durante la activación permite penetración en un proceso básico de la función inmune. Sin embargo, el estudio de las células T CD4 + vírgenes puede ser complicado debido a que representan una población muy pequeña de células en la periferia de sangre 2.
A través de microscopía de fluorescencia varios informes han estudiado la localización de diferentes moléculas implicadas en la activación de células T CD4 +, principalmente proteínas asociadas a la membrana plasmática 3. Los gangliósidos son glicoesfingolípidos que contienen ácido siálico y aunque han sido ampliamente estudiados en las células nerviosas en el que son abundantes, otras células tales como las células inmunes también expresan gangliósidos con biológicamente funciones relevantes 4,5. Hemos informado anteriormente de that durante la activación de las células T CD4 + vírgenes humanos hay una regulación por incremento de la α2,8 sialiltransferasa ST8Sia 1 (GD3 sintasa) y la sintasa GM2 / GD2, que inducen la neoexpression superficie significativa de GD2 y la regulación al alza de GD3 gangliósido 6. El estudio adicional de GD3, GD2 y otros gangliósidos en células inmunes, es necesario complementar una vista parcial a base de proteínas de la función inmune.
Comúnmente, el estudio de la expresión de gangliósidos se basa en técnicas tales como cromatografía en capa fina (TLC) 7, pero esta técnica no permite la localización espacial de los gangliósidos en la membrana plasmática o en compartimentos subcelulares, limitando el análisis biológico.
En este trabajo, se describe un protocolo para la identificación mediada por anticuerpos y localización de GD3 y GD2 gangliósidos en células T CD4 + vírgenes humanos y PBMCs después de la activación anti-CD28 anti-CD3 /. Con este protocolo se iTambién es posible analizar el gen y la expresión molecular de gangliósidos en un bajo número de células en suspensión, con la adquisición de imágenes de alta calidad 6, teniendo en cuenta el pequeño tamaño de los linfocitos (9 m).
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo descrito se puede utilizar para localizar gangliósidos o proteínas en las suspensiones de células de células T CD4 + o otras células inmunes (por ejemplo, PMBCs, figura 5) a partir de un pequeño número de células. Debido al pequeño tamaño de las células T y las propiedades no adherentes, la adquisición de fluorescencia imágenes microscópicas se obtenga información mala o baja calidad si las células están no se cumplen correctamente.
<p class="jove_co…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. José Luis Daniotti for comments. We thank the assistance to Dr. J. Arturo Pimentel and the Laboratorio Nacional de Microscopìa Avanzada-UNAM for acquisition of confocal images. I.M.-D. and T.M.V.C. were supported by grants 157634 and 253596 from Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologìa (CONACYT), Sociedad Latinoamericana de Glicobiologìa, A.C. T.M.V.-C. is recipient of a scholarship (245192) from CONACYT. We also thank the support of the Red Temática Glicociencia en Salud – CONACYT (253596).
Materials
| Advanced RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 12633-012 | Suplemented with 3% FBS |
| mouse anti human CD3 antibody | eBioscience | 16-0037-81 | OKT3 clone |
| mouse anti human CD28 antibody | ebioscience | 16-0288-81 | CD28.6 clone |
| mouse anti human GD3 antibody | Abcam | ab11779 | R24 clone |
| mouse anti human GD2 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-53831 | 14G2a clone |
| FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody |
Abcam | ab97259 | |
| Alexa Fluor 488 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21131 | |
| IgG2a antibody | |||
| Alexa Fluor 647 conjugated antimouse | Thermo Fisher Scieni¡tific | A-21241 | |
| IgG2a antibody | |||
| Hoechst 333258 | Sigma-Aldrich | 861405 | |
| Ficoll Paque-Plus | GE | 17-1440-02 | |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human | MACS Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |
| BD FACSAria II | BD Biosciences | Sorting | |
| Nunc Lab-tek chamber slide system | Sigma-Aldrich | C7182 | |
| Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus) | Olympus | Upright BX61WI and IX81 | |
| Forward sequence primer GD3 synthase | 5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GD3 synthase | 5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´ | Ref. 7 | |
| Forward sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´ | Ref. 7 | |
| Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase | 5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´ | Ref. 7 |
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