O protocolo prevê uma metodologia para solubilizar lodo granular aeróbica, a fim de extrair polímeros extracelulares de alginato-like (ALE).
To evaluate and develop methodologies for the extraction of gel-forming extracellular polymeric substances (EPS), EPS from aerobic granular sludge (AGS) was extracted using six different methods (centrifugation, sonication, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), formamide with sodium hydroxide (NaOH), formaldehyde with NaOH and sodium carbonate (Na2CO3) with heat and constant mixing). AGS was collected from a pilot wastewater treatment reactor. The ionic gel-forming property of the extracted EPS of the six different extraction methods was tested with calcium ions (Ca2+). From the six extraction methods used, only the Na2CO3 extraction could solubilize the hydrogel matrix of AGS. The alginate-like extracellular polymers (ALE) recovered with this method formed ionic gel beads with Ca2+. The Ca2+-ALE beads were stable in EDTA, formamide with NaOH and formaldehyde with NaOH, indicating that ALE are one part of the structural polymers in EPS. It is recommended to use an extraction method that combines physical and chemical treatment to solubilize AGS and extract structural EPS.
Nos últimos anos o processo aeróbio lodo granular (AGS) tornou-se um processo de tratamento biológico de águas residuais popular, aplicado com sucesso em vários de grande escala estações de tratamento de águas residuais 1. Em contraste com o processo convencional de lamas activadas, nas AGS processar os microrganismos formar grânulos, em vez de flocos 2. Estes grânulos têm melhor sedimentabilidade, são capazes de suportar cargas orgânicas mais elevadas e têm maior tolerância à toxicidade de flocos de lamas activadas 3.
Ao contrário de biofilmes, AGS é formada espontaneamente, sem o envolvimento de qualquer material de suporte 4. Em AGS, como em biofilmes, microorganismos produzem uma quantidade significativa de substâncias poliméricas extracelulares altamente hidratados (EPS) 5 para formar uma matriz de hidrogel no qual eles são auto-imobilizada 4-6. EPS são uma mistura complexa, que consiste em polissacarídeos, proteínas, ácidos nucleicos, (phospho) lipídios, substâncias húmicas e alguns polímeros intercelulares 5,7,8. Estas substâncias poliméricas interagir um com o outro por meio de forças electrostáticas, ligações de hidrogénio, forças iónicas atractivas e / ou as reacções bioquímicas, etc. 5, formando uma estrutura terciária rede densa e compacta. Os polímeros em EPS, que são capazes de formar hidrogéis 4,9 e contribuem para a formação da estrutura da rede terciária são a este respeito considerado como EPS estruturais, um subconjunto do total de EPS.
EPS são responsáveis pela estrutura química e propriedades físicas de grânulos 5. Portanto, é crucial para entender a função de cada composto EPS. Várias abordagens são aplicados para extrair EPS 10-15. No entanto, devido à sua extrema complexidade, que é quase impossível para extrair todos os componentes EPS por um método único. Até à data, não existe um "one size fits all" método de extracção EPS. A escolha do método de extracção influencia não só a quantidade total, mas também a composição dos polímeros recuperados 13,16 – 20. Dependendo do tipo de lamas e o RPE de interesse métodos diferentes são necessários.
Extraindo polímeros formadores de gel, caracterizar as suas propriedades e investigar as suas interacções com o outro e com EPS não-formadores de gel vai ajudar a revelar o papel de EPS na formação de lodo aeróbico granular. Além disso, os polímeros formadores de gel também são biopolímeros útil em aplicações industriais. Uma aplicação possível já foi demonstrada por utilização de polímeros formadores de gel de AGS como um material de revestimento para aumentar a resistência à água do papel 21.
Portanto, são necessários métodos de extracção, específicos para EPS de formação de gel. O objetivo deste estudo é desenvolver uma metodologia para extrair EPS de formação de gel da AGS. Seis métodos de extração 10-15,22, que são frequentemente utilizados na literatura, foram selecionados para extrair EPS da AGS. O montante total e da propriedade de formação de gel das EPS extraídos foram comparados para cada metodologia.
Observações para a seção de protocolo
A extracção de EPS / ALE é descrito para um volume de 50 ml e 3 g de grânulos. Estes valores são apenas orientações. Extrações com concentrações mais elevadas do grânulo pode diminuir o rendimento dos EPS extraídos. Durante a extracção de ALE a temperatura deve ser mantida constante a 80 ° C durante 30 min. O tempo necessário para a mistura a aquecer-se (cerca de 5 min) está incluído no protocolo. Além disso, a eficácia de extracção é melhorada usando uma barra de agitação magnética com o mesmo tamanho que o diâmetro do fundo do frasco. Isto irá resultar em boas propriedades de mistura e efeitos de fresagem, promovendo a extracção de EPS.
Mais tarde, na seção de protocolo, são determinados TS e VS rendimentos de todas as extrações (sobrenadante recolhidos em passos 1.1-1.6). A diálise deve ser realizada antes da TS e VS medição para diminuir possíveis erros, devido à presença de produtos químicos utilizados para a extracção. UMAMWCO de 3500 Da é recomendado para remover estes produtos químicos, mantendo as macromoléculas EPS dentro do saco de diálise. O saco de diálise deve ter um volume maior do que o volume do extracto. Isto é necessário, porque o volume do extracto irá aumentar durante a diálise (por exemplo, para extracção de EDTA até aumento de volume de 40%). A extensão da remoção química por diálise pode ser determinada medindo o pH na amostra antes e após a diálise. Alternativamente, as medições de condutividade da água de diálise mostrar a extensão da remoção de iões.
Para obter ALE total extraído a partir dos EPS (passos 1.6 e 2) o passo de diálise é opcional. No entanto, a diálise tem três vantagens: reduz a quantidade de HCl necessário para a precipitação, que melhora a transferência de massa de ácido no extracto e diminui o teor de cinzas do ALE obtido. Para a precipitação do ALE é recomendado o uso de um copo de vidro com um volume muito maior do que a extract. Na 2 CO 3 é normalmente administrado em doses a extracção. O HCl adicionado vai reagir primeiro com o Na 2 CO 3 a esquerda no extracto, resultando na formação de dióxido de carbono e, se a amostra não foi dializada antes, na formação de espuma. Durante a adição de HCl, o extracto deve ser agitada lentamente com uma barra de agitação magnética com o mesmo tamanho que o fundo do copo. Uma barra de agitação deste tamanho e a agitação lenta irá resultar em uma mistura uniforme sem quebrar a estrutura do precipitado. Se grumos de gel de ácidos são formados no extracto, a taça deve ser rodado ligeiramente à mão. A precipitação é realizada com uma concentração de ácido de 1 M para evitar um grande aumento de volume do extracto, enquanto ainda se obtém uma distribuição homogénea do ácido na amostra. Maiores concentrações de ácido pode resultar numa formação de diminuição do pH regional e grumos de gel ácidas. Um pH inferior a 2,0 diminui a quantidade de ALE que pode ser recuperada, provavelmente devido a alterações estruturaisdos polímeros a um pH mais baixo. Por conseguinte, é importante manter o pH final de 2,20 ± 0,05.
limitações
O método de extracção ALE pretende extrair polímeros extracelulares estruturais do RPE de AGS ou biofilmes em geral e não se destina a extrair todas EPS presentes. Para extrair todos os EPS, uma combinação de mais de um método de extracção é necessária. Além disso, como mostrado com o aumento do rendimento VS EPS por aplicação de uma extracção dupla e quádrupla, uma única extracção não irá extrair todos os EPS estruturais. extracção ALE é um método de extracção de EPS dura, combinando mistura constante com as condições de calor e alcalino-terrosos. Por este motivo, é possível que algum material intracelular é extraído juntamente com o EPS. Embora a lise das células pode ser causado por técnicas de extracção química e física (sonicação 31,32, 31,32 NaOH, EDTA 11,32, CER 32, 32 de calor e elevada tensão de corte por taxas mixing 19), a presença de material intracelular em EPS recuperados ainda precisa de ser verificada. A propriedade iônica de formação de gel das EPS extraídos é o foco principal desta pesquisa, se o EPS recuperado contém material intracelular não foi analisada. A pesquisa futura incidirá sobre a identificação de material intracelular nas EPS extraídos.
De solubilização da matriz de hidrogel de AGS é crucial para extrair EPS estruturais
EPS forma uma matriz de hidrogel denso e compacto em AGS. Embora EPS contém diversas classes de macromoléculas orgânicas, tais como polissacáridos, não proteínas, ácidos nucleicos, (fosfo) lípidos, substâncias húmicas e alguns polímeros intercelulares 7,5,8, todos eles formam um gel. Apenas esses polímeros formadores de gel são aqui considerados como polímeros estruturais em EPS.
O objetivo do EPS extrações é a primeira a solubilizar EPS e, em seguida, para recolher os EPS solubilizados. Se os EPS estruturais (ou seja, tele EPS formando um hidrogel) é o alvo de extracção, a matriz de gel de AGS tem de ser solubilizada em primeiro lugar. Apenas os métodos que podem solubilizar a matriz de gel são capazes de extrair EPS estruturais. Nesta pesquisa, alguns usados frequentemente EPS métodos de extração, como a centrifugação de 10 – 15, ultra-sons 10,14,15, EDTA 10 – 12,14,15, formaldeído + NaOH 10 – 15 e formamida + NaOH 13 não poderia de forma eficiente isolar o estrutural EPS. Isto é devido ao facto de a matriz de hidrogel dos grânulos aeróbicas não foi solubilizado por estes métodos. Por esta razão, os testes de estabilidade na secção 4 só foram realizadas com as condições presentes em EDTA, formamida + NaOH e formaldeído + extração de NaOH. Estes três extracções não foram capazes de isolar EPS estruturais, mas ainda obtido o maior rendimento VS EPS além de Na 2 CO 3 a extracção. condições Sf o Na 2 CO 3 a extracção não foram aplicadas como este método de extracção claramente solubilizado a matriz AGS. Daí as condições aplicadas durante o teste de estabilidade foram consideradas representativas.
Extração com resina de troca catiônica (CER), um outro método de extração EPS usado com freqüência, não foi considerado para esta comparação, como os estudos anteriores sobre EPS extracção com CER não deu melhores resultados do que as extrações químicas utilizadas aqui.
Gel de formação de EPS em AGS
EPS formador de gel são considerados como os EPS estruturais na matriz de hidrogel de AGS. É importante ressaltar que existem vários tipos de hidrogéis tais como géis iônicos, géis induzidas pela temperatura e géis induzidas pH. Este estudo incide apenas sobre EPS que formam géis iônicos. No que diz respeito à grande fracção de material de gel estrutural extraída, isto é provável que seja o EPS estruturais dominantes. Existem, certamente, possibilidades que outros tipos de EPSque forma diferentes tipos de hidrogéis (por exemplo, o pH do gel induzida 28) existem no mesmo ou em outro tipo de grânulos aeróbias. No entanto, não importa que tipo de hidrogel é alvo, solubilização da matriz de gel EPS é o passo mais importante para extrair EPS de formação de gel.
Atualmente, pouca pesquisa foi feita em EPS estruturais de lodo granular. A extracção ALE descrito neste protocolo é capaz de extrair EPS formadores de gel de AGS e será utilizado em estudos futuros para caracterizar EPS estruturais. Mais pesquisa precisa ser feito na AGS, EPS estruturais e EPS não-estruturais para compreender melhor o processo e função de granulação e EPS. Especialmente os seguintes três pontos precisam ser investigados: por microorganismos produzem uma quantidade tão grande de EPS, qual é a composição exata do EPS e como é a composição do EPS modificada dependendo das mudanças ambientais. Detecção e análise de todos os compostos envolvidos e suas interactions irá ajudar a compreender biofilmes e como usá-los a nosso favor.
The authors have nothing to disclose.
This research was financially supported by the SIAM Gravitation Grant 024.002.002, the Netherlands Organization for Scientific Research and by the Dutch Technology Foundation (STW – Simon Stevin Meester 2013). The authors want to thank Mario Pronk for providing the granular sludge samples.
250 ml baffled flask | Kimble | 25630-250 | |
1000 ml glass beaker | VWR | 213-1128 | |
RCT basic, magnetic stirrer with thermometer | IKA | 3810000 | |
sodium carbonate decahydrate | Merck KGaA | 1063911000 | |
50 ml centrifugation tubes | greiner bio-one | 227261 | |
Multifuge 1 S-R, centrifuge | Heraeus/Thermo Scientific | – | |
hydrochloric acid, 37 % | Sigma-Aldrich | 30721-1L-GL-D | |
250 ml glass beaker | VWR | 213-1124 | |
calcium chloride dihydrate | Merck KGaA | 1023821000 | |
1 ml Pasteur Pipette | Copan | 201C |