Summary

在小鼠实验为细菌性肺炎的诱导和表型非侵入性和技术上非密集型方法

Published: September 28, 2016
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Summary

几种方法已在文献中的小鼠模型细菌性肺炎进行了描述。在此,我们描述了用于通过移液到口咽细菌接种物的抽吸( ,吸入)诱导肺炎的非侵入性的,廉价的,快速的方法。对于肺先天免疫应答的评估下游方法也是详细说明。

Abstract

虽然社区获得性肺炎仍然是一个重大的公共卫生问题,细菌性肺炎小鼠模型中我们底层的细胞和分子发病机制的认识,最近促进显著临床进展。 在活体小鼠模型捕捉宿主防御反应的综合生理和弹性的方式不被替代的,简化的离体方法揭示。几种方法已在文献中小鼠细菌肺内接种,包括雾化,鼻内递送,“盲”和可视化的条件下经口气管插管,和经皮气管插管进行了描述。所有的方法都具有相对的优点和局限性。这里,我们详细描述用于细菌的气管内递送,通过鼠标涉及抽吸( ,吸入)的非侵入性的,在技术上不密集的,廉价且快速的方法的同时,在全身麻醉下吸移到口咽感染接种物。这种方法可用于各种各样的无腐蚀性生物和化学制剂的肺递送,并且相对容易学习,即使对于肺程序最小先前经验的实验室。除了描述的吸入性肺炎的方法,我们也用于测定随后在体内小鼠的肺先天免疫反应,特别是提供一步一步的程序,用于量化细菌清除和感染呼吸道的细胞免疫应答的方法。这种集成和简单的肺炎评估方法允许的遗传和环境操纵在肺先天免疫效果快速和强大的评估。

Introduction

社区获得性肺炎仍然感染在美国死亡的主要原因,死亡率在过去40年,尽管在接种疫苗的改进和抗生素的战略1,2整体变化不大。尽管在公共卫生水平缺乏可察觉进展,近年来引人注目的进展已在我们的肺炎的分子和细胞发病机理的理解制成,具有许多的向前通过使用肺部感染的小鼠模型成为可能这些步骤。小鼠的遗传易处理性,鼠和人的免疫系统,和鼠靶向免疫试剂繁多,已成为商用的相似性都共同促进该领域的快速进步。

在文献中描述的细菌性肺炎的小鼠模型一般在四种情况之一的技术路线依赖于病原体接种:ⅰ)雾化; II)INTRanasal交付; III)口服交货;和iv)手术气管内注射( 气管切开术)3。感染的所有路线各有优缺点3。在上气道的特定,相对曝光,电位为口鼻菌群,对于全身麻醉要求的混合,递送至远端肺接种,的递送病原体大叶性肺炎分布,技术专长的要求,和程序的发病率的变异性在这些广泛地变化的方法。

常用的口服感染技术包括通过无论是“瞎子”(非可视)的方式,或直接在可视化喉气管3-5(translaryngeal)插管。这两种方法,而健壮的,需要大量的训练,还可以携带创伤的风险的上气道。在本报告中,我们描述了经口感染的一个技术上的非密集,非侵入性的,廉价且快速的方法,W特此细菌( 肺炎在所提供的示例克雷伯 )吸移到麻醉小鼠的口咽通过抽吸( ,吸入)递送至肺部。我们和其他人已经成功地6-9使用了吸入性肺炎的技术。这种多功能,也容易学习肺递送方法可以扩展至输送许多额外的非苛性剂到肺部,包括细胞因子和其它蛋白质,病原体相关分子( 脂多糖),细胞( ,继转移),和毒素( 例如 ,博莱霉素)。除了讨论重要的技术方面的考虑,我们还描述了一个综合的,定量的方法来评估随后的宿主反应肺炎,包括细菌清除下游测量( 菌落形成单位[CFU]定量肺和外周器官)和白细胞堆积在领空。

Protocol

所有实验均按照动物福利法和人文关怀和实验动物的使用美国公共卫生服务政策审核后,由动物护理和NIEHS的使用委员会进行。 1. K.的制备肺炎文化注意:执行在生物安全2级(BSL2)罩或其他BSL2指定区域的所有步骤,并丢弃每个学院BSL2指引浪费。 对于K的悬浮生长肺炎 ,细菌解冻的甘油和转移1毫升K的接种工作文?…

Representative Results

C57BL / 6小鼠被感染K的2000 CFU 肺炎 43816(2型),通过口咽部吸入肺。在这个剂量,一般老鼠开始出现临床症状12-24小时后感染,包括嗜睡,皱皮,体重减轻5%-10%( 图2A)的。内48-72小时感染后,许多小鼠表明,通常是由平均20%的重量损失和结果的在具有降低活性驼背姿势之前和响应减少到刺激疾病和发病的症状。更长的持续时间的研究中,可?…

Discussion

细菌性肺炎小鼠模型,用基因靶向和体内生物和药物干预合作,提供了重要的见解肺宿主防御反应。伟大的进步特别是取得我们的支配中性粒细胞招募到受感染空域10,11趋化因子和粘附分子的理解。 体内肺炎模型,不同于基于细胞或替代办法,还提供了关键洞察内分泌被感染的肺和其他器官,如肝脏(急性期反应)之间发生的通信12和肾上腺(应力糖皮质激素)13…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Materials

Klebsiella pneumoniae, serotype 2 ATCC 43816
Tryptic soy broth Becton Dickenson 211825
Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" Claflin Medical Equipment MEDC-031122
Hema 3 Solution 1 Fisher 23-122-937
Hema 3 Solution 2 Fisher 23-122-952
Hema 3 Fixative Fisher 23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes Fisher 14-826-87
Lithium heparin plasma collectors Fisher 2675187
L-shaped disposable spreaders Lab Scientific DSC
1x PBS, pH 7.4 prepared in-house n/a Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)   
ACK lysis buffer prepared in-house n/a NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4

References

  1. Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
  2. Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
  3. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
  6. Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
  7. Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
  8. Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
  9. Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
  10. Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
  11. Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
  12. Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
  13. Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
  14. Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
  15. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
  16. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
  17. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  18. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).

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Cite This Article
Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).

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