Summary

Bewertung der Wirksamkeit und Toxizität von RNAs Targeting HIV-1-Produktion für den Einsatz in Gene oder Arzneimitteltherapie

Published: September 05, 2016
doi:

Summary

Methods to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps of the HIV-1 replication cycle are described. These methods are useful for screening new molecules and optimizing the format of existing ones.

Abstract

Small RNA therapies targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are among the top candidates for gene therapy and have the potential to be used as drug therapies for HIV-1 infection. Post-integration inhibitors include ribozymes, short hairpin (sh) RNAs, small interfering (si) RNAs, U1 interference (U1i) RNAs and RNA aptamers. Many of these have been identified using transient co-transfection assays with an HIV-1 expression plasmid and some have advanced to clinical trials. In addition to measures of efficacy, small RNAs have been evaluated for their potential to affect the expression of human RNAs, alter cell growth and/or differentiation, and elicit innate immune responses. In the protocols described here, a set of transient transfection assays designed to evaluate the efficacy and toxicity of RNA molecules targeting post-integration steps in the HIV-1 replication cycle are described. We have used these assays to identify new ribozymes and optimize the format of shRNAs and siRNAs targeting HIV-1 RNA. The methods provide a quick set of assays that are useful for screening new anti-HIV-1 RNAs and could be adapted to screen other post-integration inhibitors of HIV-1 replication.

Introduction

Eine Einschränkung der derzeitigen HIV-1-Behandlungen ist, dass sie chronisch Fortschreiten der Krankheit zu verhindern, verabreicht werden müssen. Transplantation von HIV-1 resistent T – Lymphozyten oder hämatopoetischen Stammzellen, hat das Potenzial , Langzeitkontrolle der HIV-1 – Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteltherapie 1,2 und kann auch ein wirksamer Ansatz sein , um eine HIV-1 Heilung zu erreichen 3. Ein Weg , um Zellen resistent gegen HIV-1 – Replikation rendern ist ein oder mehrere Gene einzuführen , kodierend für anti-HIV-1 RNAs oder Peptide in einem infizierten Individuum Zellen während einer autologe Transplantation 4. Mehrere Kandidaten anti-HIV-1 – Gene wurden mit einigen klinischen Studien Eingabe in Kombinationen von zwei oder drei 5 6, die die Entwicklung von HIV-1 Resistenz gegenüber einem einzelnen Gen zu verhindern.

Anti-HIV-1 RNAs sind unter den ersten Kandidaten für die Kombination Gentherapie aufgrund ihrer niedrigen Potential Immunantworten hervorzurufen, und weil siesind von sehr kurzen Gensequenzen transkribiert. Einige anti-HIV-1 RNAs wurden entwickelt Viruseintritt und Integration zu zielen. Allerdings sind die meisten anti-HIV-1 – RNA das Ziel nach der Integrationsschritte im viralen Lebenszyklus (Abbildung 1). Nachintegration Inhibitoren umfassen Decoy RNAs, die Targeting – HIV-1 – regulatorischen Proteine ​​Tat oder Rev 1 und Antisense-RNAs beruhen, verschiedene Standorte in HIV-1 – RNA – Targeting, wie Ribozyme 7, 8 und shRNAs U1i RNAs 9. Verfahren, die die Wirksamkeit von Anti-HIV-1 RNAs gehören die Überwachung der viralen Replikation in Zellen , transduziert mit Genen , kodierend für Kandidaten RNAs und Mess virale Produktion in Zellen , transient transfiziert mit Plasmiden exprimieren Kandidaten RNAs und eine HIV-1 – Expressionsplasmid 10 zum Vergleich verwendet wurden -13. Wir haben zuvor eine HIV-1 – Produktion zu screenen Assay HIV-1 RNA für neue Ribozym – Zielstellen 13-15 verwendet. Diese Verfahren sind seit verfeinert das Format einer RNA zu optimieren,Interferenz – Molekül von dem Plasmid DNA als shRNA oder geliefert als synthetisches siRNA 16 ausgedrückt. Der Assay misst die Produktion von reifen Viren aus menschlichen embryonalen Nieren (HEK) , 293T – Zellen, und kann verwendet werden , die Auswirkungen von Inhibitoren zu vergleichen , die nach der Integrationsschritte in der HIV-1 – Replikationszyklus Ziel (Abbildung 1). Für Inhibitoren , die Pre-Integrationsschritte Ziel, alternative Assays wie eine TZM-bl Zelle Infektiosität Assay 17 nötig sind , um antivirale Wirksamkeit zu bewerten.

Wichtige Sicherheitsbedenken für die Lieferung von Anti-HIV-1-RNA in der Klinik sind potenzielle Nebeneffekte auf die menschliche RNAs oder Proteine, und die Aktivierung der angeborenen Immunsensoren. Um die Toxizität von anti-HIV-1 siRNAs bewerten, haben wir einen Zelllebensfähigkeitstest in verschiedenen Zelllinien 16 verwendet. Wir maßen auch die Aktivierung der doppelsträngigen RNA-Immunsensoren, RNA aktivierte Proteinkinase R (PKR) und Toll-like-Rezeptor 3 (TLR3), sowie expression des Interferon-stimulierte Gen, ADAR1 p150. Diese Assays können verwendet werden, um zu bestätigen, dass die Wirksamkeit von Anti-HIV-1-RNA ist nicht auf indirekte Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen oder Immunsensoraktivierung. Sie sind auch nützlich in Ausnahme von Kandidaten RNAs mit potentiellen Toxizitäten von der weiteren Entwicklung.

In den folgenden Protokolle, Verfahren neue therapeutische RNAs zu identifizieren und zu optimieren das Format der bestehenden beschrieben werden. Die Verfahren sind nützlich für das Screening RNA basieren Nachintegration Inhibitoren der HIV-1 – Replikation und angepasst werden könnten andere post-Integration – Inhibitoren, wie kleine Moleküle Targeting Rev vermittelte Export von viraler RNA 18 oder CRISPR / CAS – Systeme entwickelt , um screenen integrierten Ziel HIV-1 DNA 19.

Protocol

1. Zellen und Transfektionen Kultur HEK 293T Zellen in Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin ergänzt. Vorbereiten eines 2 x 10 5 Zellen / ml – Suspension in dem Zellkulturmedium. In 500, 100 und 1000 & mgr; l der Zellsuspension in jede Vertiefung von 24-Well, 96-Loch – und 12-Well – Platten, die für die virale Produktion, die Lebensfähigkeit der Zellen und Immunaktivierung Assays, bzw. (2A). V…

Representative Results

Eine allgemeine schematische Darstellung der Verfahren ist in Figur 2 mit einem Beispiel der Transfektion Plan für drei Test RNAs und einer Steuer RNA bereitgestellt in 2B gezeigt. Für die virale Produktion und Zelllebensfähigkeitstests, die Auslese für jedes Testkonstrukt wird auf eine negative Kontrolle normalisiert. Replikate werden in Sätzen transfiziert, so daß jeder Test RNA an seinen benachbarten negativen Kontrolle normiert. Dies geschieht,…

Discussion

Die HIV-1 – Produktion beschriebenen Assay wurde unter Verwendung von HEK293T – Zellen (Figur 2) durchgeführt und ist ähnlich Assays verwendet HIV-1 – RNA für eine effektive Ribozym 13, shRNA 10,29, siRNA 30 und U1i RNA 11,31 Zielstellen zu screenen. Mit Hilfe verschiedener Methoden HIV-1-Produktion zu quantifizieren, wurden die meisten Studien virale Produktion 48 Stunden nach der Co-Transfektion eines HIV-1-Expressionsplasmid mit Kandidaten RNAs gemessen….

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die vorgestellten Arbeiten wurden von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) unterstützt (gewährt DCB-120266, PPP-133377 und HBF-348967 zu AG).

Materials

DMEM HyClone GE Healthcare SH30243.01
FBS HyClone GE Healthcare SH30396.03
Penicillin/Streptomycin Gibco Thermo Fisher 15140-122
Cell culture plates, 96 well, 24 well, 6 well. Corning 353075, 353047, 353043
Micro tubes Axygen Corning 311-08-051
Low molecular weight Poly I:C InvivoGen 3182-29-6
DharmaFECT-1 Dharmacon T-2001-01 transfection reagent for synthetic RNAs
TransIT-LT1 Mirus MIR 2300 transfection reagent for RNA expression plasmids
Nonidet P40 (NP-40) USB 19628
[32P]dTTP Perkin Elmer BLU505H
poly(A) RNA template  Sigma-Aldrich 10108626001
oligo(dT)12-18 DNA primer Thermo Fisher 18418-012
DEAE filtermat paper  Perkin Elmer 1450-522
Microplate scintillation counter Perkin Elmer 1450-024
MTT Sigma-Aldrich M-2128
DPBS HyClone GE Healthcare SH30028.02
Microplate spectrophotometer Bio-rad 1706930
Lysis buffer tablets Roche 4693159001, 4906837001 protease and phosphatase inhibitors
Microcentrifuge Eppendorf 5415R
Bradford reagent Bio-rad 500-0006
Gel running chamber Hoefer SE600
Semi-dry transfer cell Bio-rad 1703940
Protein ladder EZ-Run Thermo Fisher BP3603-500
Nitrocellulose membrane Bio-rad 162-0094
BSA Sigma-Aldrich A9647-1006
Antibody stripping solution Millipore 2504
ECL – Pierce Thermo Fisher  PI32106
ADAR1 antibody from Dr. B.L. Bass
phospho-T446-PKR antibody Abcam ab32036
phospho-S396-IRF3 antibody Cell Signaling 4947
PKR antibody from Dr. A. Hovanessian
IRF3 antibody Cell Signaling 11904
Actin antibody Millipore MAB1501
Peroxidase-labeled goat anti-rabbit KPL 474-1506
Peroxidase-labeled goat anti-mouse KPL 474-1806
Ponceau S  Sigma-Aldrich 6226-79-5

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Scarborough, R. J., Adams, K. L., Del Corpo, O., Daher, A., Gatignol, A. Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy. J. Vis. Exp. (115), e54486, doi:10.3791/54486 (2016).

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