tendões flexores na mão são comumente feridos, levando a mão função prejudicada. No entanto, a resposta de cura de tecido cicatricial não está bem caracterizada. Um modelo murino de cura do tendão flexor é demonstrada aqui. Este modelo pode melhorar a compreensão global do processo de cura e avaliar abordagens terapêuticas para melhorar a cicatrização.
Tendão conecta o músculo esquelético e o osso, facilitando o movimento de quase todo o corpo. Na mão, tendões flexores (STF) permitem flexão dos dedos e função geral mão. Lesões ao SFT são comuns, e cura satisfatória é muitas vezes prejudicada devido ao tecido cicatricial em excesso e aderências entre o tendão eo tecido circundante. No entanto, pouco se sabe sobre os componentes moleculares e celulares de reparação FT. Para esse fim, num modelo murino de reparação FT que recapitula muitos aspectos de cicatrização em humanos, incluindo a gama de movimento diminuída e diminuição propriedades mecânicas, tem sido desenvolvido e descrito anteriormente. Aqui uma demonstração em profundidade deste procedimento cirúrgico é fornecido, envolvendo o corte transversal e subsequente reparação do tendão flexor longo dos dedos (FDL) na pata posterior murino. Esta técnica pode ser usado para realizar a análise da linhagem de diferentes tipos celulares, avaliar os efeitos do ganho do gene ou a perda de função, e para testar a eficácia de intervenções farmacológicas no processo de cicatrização. No entanto, existem duas limitações principais para este modelo: i) o tendão FDL na porção média da pata posterior de murino, em que a transecção e reparação ocorrer, não é rodeado por uma bainha sinovial. Portanto, este modelo não leva em conta a potencial contribuição da bainha para o processo de formação de cicatriz. ii) A fim de proteger a integridade do local de reparação, o FT é libertado na junção miotendínea, diminuindo as forças mecânicas do tendão, provavelmente contribui para aumentar a formação de cicatriz. Isolamento de células suficientes a partir do tecido de granulação do FT durante o processo de cura para a análise de citometria de fluxo demonstrou ser um desafio; citologia centrifugação a concentrar-se nestas células é um método alternativo utilizado, e permite a geração de preparações de células no qual a rotulagem de imunofluorescência pode ser realizada. Com este método, a quantificação de células ou proteínas de interesse durante FT cura torna-se possível.
tendões flexores da mão de obra em conjunto com os músculos flexores do antebraço e bainhas digitais para permitir a flexão dos dígitos e função de agarrar a mão. tendões flexores executar ao longo do aspecto palmar da mão; este local relativamente superficial muitas vezes resulta em lesões nos tendões flexores durante um trauma para a mão. Tendões curar através de uma resposta do tecido da cicatriz em vez de regeneração do tecido do tendão normal de 1. Embora este tecido cicatricial dá continuidade ao tendão, função dramaticamente é diminuída em relação ao tendão saudável. Compósitos tecido do tendão-de cicatriz são caracterizados por propriedades mecânicas com deficiência 1, tornando os tendões reparados mais propensos à ruptura. Além disso, o tecido cicatricial não tem a organização da estrutura de fibra de colagénio de tendão nativa, resultando num aumento do tamanho do tendão e grandes quantidades. Dadas as limitações anatômicas do tendão-bainha, mesmo um modesto aumento no tamanho do tendão pode drasticamente vermelhoUCE a função de deslizamento do tendão, e, portanto, gama dígitos de movimento e função da mão.
Antes de lesões década de 1960 para os tendões flexores, particularmente os da Zona II da mão, não foram rotineiramente reparado devido a complicações graves em cura que surgiram com esses reparos 2. Esta área da mão foi referido como 'terra de ninguém' 3. No entanto, as melhorias nas técnicas cirúrgicas, padrões de sutura e protocolos de reabilitação de fisioterapia têm resultados do tendão flexor reparos 2 melhorou dramaticamente. Apesar destes avanços, até 40% das reparações resultar na formação de aderência suficiente para impedir a função da mão 4. Portanto, uma abordagem biológica é necessário para melhorar a cicatrização. Infelizmente, muito pouco se sabe sobre o processo de cicatrização do tendão no nível celular e molecular. Assim, o objectivo foi desenvolver um modelo murino que poderia ser usado para melhorar a understandin fundamentaisg dos componentes celulares e moleculares da cicatrização do tendão flexor e a resposta de formação de cicatrizes, como um meio para identificar novos alvos terapêuticos para melhorar a cicatrização.
modelos animais maiores têm sido fundamentais para aprofundar a compreensão do processo de cicatrização do tendão flexor. Canino e coelho estudos demonstraram tanto a capacidade de cura intrínseca e extrínseca de tendões flexores 5,6, a importância de movimento passivo precoce controlada para minimizar a formação de aderência em relação à imobilização 7, bem como os efeitos de diferentes padrões de sutura sobre o processo de cura 8 , 9. Além disso, o modelo canino tem sido útil em testes de abordagens de engenharia de tecidos para melhorar a cicatrização de translação 10. No entanto, existem várias vantagens importantes na utilização de um modelo de murino em relação a um modelo animal de grande porte, incluindo o custo relativo, da disponibilidade de reagentes específicos de murino, e a facilidade de gerar KNOC mundialk-outs ou construções de deleção / superexpressão de tecidos específicos. Além disso, as semelhanças funcionais entre humanos e ratinhos com respeito aos tendões flexores 11 indicam a utilidade potencial no desenvolvimento de um modelo de murino.
Desenvolvimento de um modelo murino de transecção do tendão flexor e reparação imita muitos aspectos da cura clínica, incluindo a formação de tecido cicatricial abundante e propriedades mecânicas prejudicada. O modelo descrito aqui não é uma verdadeira recapitulação da prática clínica devido à transecção do FDL na junção miotendínea, a fim de proteger o local de reparação. Além disso, este modelo não leva em conta a contribuição de células da bainha sinovial à resposta de cura, já que não há bainha sinovial que cobre a porção média do tendão onde o reparo ocorre. Apesar destas limitações, este modelo tem a vantagem de intervalo de geração de adesões de limitação de movimento, que ainda tem de ser demonstrada em modelos murinos que mais closEly aproximar o cenário clínico. Este modelo tem sido utilizado para avaliar knock-out modelos de ratinho 12,13, e para testar diferentes abordagens farmacológicas para melhorar a cicatrização 14-17. As análises histológicas deste modelo, usando imuno-histoquímica e hibridação in situ, pode fornecer informações importantes para a localização de genes-chave e proteínas durante a cura. No entanto, histologia fornece apenas uma análise espacial do corte transversal e não permite a quantificação ao longo de todo o tecido. A citometria de fluxo representa uma abordagem mais quantitativa, mas apenas um número muito limitado de células podem ser isoladas a partir do tecido de cicatrização do tendão no modelo de ratinho, e este número é ainda mais reduzida durante os passos de fixação, permeabilização e lavagem. Tendo isto em conta a, citometria de fluxo torna-se uma abordagem inviável devido ao número de animais que seria necessária. Um método alternativo é necessário para preservar a maioria desta população de células pequenas, a fimpara caracterizar ainda mais o meio de cura. O método utilizado para alcançar este objetivo, mostrado aqui, envolve a concentração das células isoladas através de centrifugação citologia numa lâmina de vidro, seguido por imunocitoquímica. No presente estudo EdU (5-etinil-2'desoxiuridina, um análogo da timidina) incorporação e rotulagem subsequente foi usada para determinar o estado proliferativo relativa de células no local de cicatrização. Esta abordagem pode ser aplicada para testar a eficácia dos tratamentos farmacológicos sobre a proliferação celular, o gene de knock-out ou sobre-expressão, ou para identificar e quantificar as populações de células diferentes.
O procedimento cirúrgico para um modelo murino de transecção completa e reparação do flexor longo dos dedos tendão é apresentado neste estudo. Além disso, uma nova aplicação de concentrar populações de células pequenas com citologia centrífuga é demonstrada, permitindo a análise imunocitoquímica quantitativa do ambiente celular durante a cicatrização do tendão flexor. Este modelo de reparação do tendão flexor demonstra uma resposta de cura reprodutível, que pode ser utilizado para avaliar mudanç…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi parcialmente apoiado pela Sociedade Americana de Cirurgia do Prêmio Pilot Mão e NIH / NIAMS 1K01AR068386-01 (a AEL) e NIAMS / NIH P30AR061307.
Surgical preparation | |||
C57BL/6J mice | Jackson Laboratories | 000664 | |
Ketamine | Hospira | NDC# 0409-2051-05 | |
Xylazine | Lloyd Inc. | NDC# 61311-482-10 | |
Buprenorphine | Par Pharmaceutical Inc. | NDC# 42023-179-10 | |
0.9% sodium chloride irrigation | Hospira | NDC# 0409-6138-03 | For preparation of ketamine/xylazine and buprenorphine solutions |
1ml syringe | BD | 309659 | |
30G needle | BD | 305106 | |
Povidone-Iodine solution | Aplicare | 82-226 | |
70% ethanol | |||
Puralube vet opthalmic ointment | Dechra Veterinary Products | NDC# 17033-211-38 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Surgical tools | |||
Portable balance 200g | Ohaus | SP202 | |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15124-12 | |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
Needle holders | Fine Science Tools | 91201-13 | |
Micro spring scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Micro needle holders | Fine Science Tools | 12061-02 | |
5-0 nylon sutures | Ethicon | 668G | |
8-0 microsurgery nylon sutures | Ethicon | 2808G | |
Lab-Line histology slide warmer | Barnstead International | 26025 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cytospin method | |||
Collagenase Type I, lyophilized | Life Technologies | 1700-017 | |
Bovine Serum Albumin | Cell Signaling Technologies | 9998S | |
1X PBS | Thermo Fisher | 10010-023 | |
Cytology funnels | Fisher HealthCare | 10-354 | |
HistoBond+ microscope slides | VWR | 16005-110 | |
Cytospin 2 centrifuge | Shandon | SH-CYTO2 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Immunocytochemistry | |||
Slide staining tray with black lid | IHC World | M920-2 | |
Click-iT Plus EdU Imaging Kit | Life Technologies | C10639 | Includes EdU and Hoeschst 33342 |
Immedge hydrophobic barrier pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
ProLong Diamond mounting medium | Thermo Fisher | P36970 | |
Glass coverslips 24x50mm #1.5 | |||
Clear nail polish |