דו"ח זה מתאר פרוטוקול מעוקב להבהיר ביופסיות עור עכבר בעובי מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון, תאים מתרבים, ו sebocytes ברזולוצית התא הבודדה ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי.
העור הוא חיוני להישרדות שלנו. השכבה החיצונית באפידרמיס מורכב האפידרמיס interfollicular, שהנה אפיתל קשקשיים מרובדת המכסה את רוב הגוף שלנו, ואת הנספחים אפידרמיס כגון זקיקי השיער ובלוטות זיעה. האפידרמיס עובר התחדשות לאורך כל החיים בתגובה לפציעה. זו מופעלת כברירת K14 להביע אוכלוסיות תאי גזע / אב אפידרמיס הבזליים כי מוסדרים באופן הדוק על ידי מנגנוני ויסות מספר פעילים בתוך האפידרמיס בין האפידרמיס הדרמיס. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה לברר ביופסיות עור בעובי עכבר מלאות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון K14, Ki67 שכותרתו מתרבה תאים, הנילוס האדום שכותרתו sebocytes, ו DAPI תיוג גרעיני ברזולוצית תא בודדת ב 3D. שיטה זו מאפשרת הערכה מדויקת וכימות של האנטומיה העור והפתולוגיה, ושל פנוטיפים אפידרמיס החריגים קווי עכבר מהונדסים גנטי. הפרוטוקול מעוקב הוא הדואר טוב ביותר השיטה זמינה עד כה כדי לחקור אינטראקציות מולקולריות תאיות ב ביופסיות עור בעובי מלאות ברזולוצית תא בודדת.
העור הוא חיוני להישרדות שלנו. הוא מורכב משלושה רבדים עיקריים האפידרמיס החיצוני, בדרמיס ובהיפודרמיס. האפידרמיס היא רקם משובים מאוד. זהו אפיתל מרובדת קשקש, המורכב בעיקר של קרטינוציטים. קרטינוציטים נולדים בשכבת הבסיס, ולעבור כלפי מעלה דרך שכבות suprabasal תוך הבחנה, ובסופו של דבר הם שופכים בשכבת cornified החיצונית כחודש לאחר הלידה שלהם. האפידרמיס מפתחת מספר נספחים כולל זקיקי השיער ובלוטות חלב. זקיקי השיער גם להתחדש באופן מחזורי לאורך כל החיים 1. קיבולת ההתחדשות של האפידרמיס מופעלת על ידי נוכחות של תאי גזע ובתאים נמצאים בשכבת הבסיס של האפידרמיס interfollicular ושיער זקיק 2.
מסלולי איתות רבים היו מעורבים בפיתוח אפידרמיס והתחדשות. חלקם מתרחשים בתוךהאפידרמיס בלבד, כגון מסלול הקיפוד. אירועי איתות אחרים מתקיימים בין הדרמיס לאפידרמיס 3. לדוגמא, אותות Wnt מן הדרמיס נחשבים חשוב להתפתחות זקיק שיער, והם מופרשים על ידי פטמית עורי בתחילת anagen להפעיל התפשטות תאי זקיק שיער בליטת גזע / ובתאים וצמיחת זקיק שיער 4. חשוב להבין את המנגנונים התאיים ומולקולריים השולטים בהתפתחות אפידרמיס והתחדשות כדי להבין טוב יותר כיצד הם עשויים להיות מוטרדים במחלת עור משובים כגון סרטן העור.
מאמר זה מתאר ליר C, U nobstructed קוקטיילי B גשם ואני maging ו- C ניתוח omputational (מעוקב) פרוטוקול 5-7 להבהיר הכנות עור הר שלמות, ולדמיין דפוסי ביטוי חלבון ב 3 ממדים ברזולוצית תא בודד על ידי מיקרוסקופיה confocal. השיטה מעוקב כרוכה טבילה של עוררקמות בשני בקבוקים כימיים מבוסס aminoalcohol. פתרונות אלה להתאים את המדדים השבירים במדגם העור, משאירים את הרקמה שקופה והחלבונים ללא פגע, המאפשר immunodetection ברזולוצית תא בודד.
שימוש בפרוטוקול מעוקב זה, הבסיס, מתרבים אוכלוסיות keratinocyte באפידרמיס interfollicular ובסופו של זקיק השיער הם צילמו ב ביופסיות עור בעובי מלא של עכברים wildtype באמצעות אנטי Keratin14 (K14) ונוגדנים אנטי Ki67. בלוטות החלב ב ביופסיות עור wildtype היו דמיינו גם באמצעות מכתים האדום הנילוס. לבסוף, אוכלוסיות keratinocyte הבסיס ב wildtype ו hyperplastic YAP2-5SA-ΔC ביופסיות עור הושוו 8.
פרוטוקול מעוקב זה מאפשר הערכה חזותית של ביטוי חלבון ביופסיות עור בעובי מלאה ברזולוצית תא בודדת, והוא מהווה כלי חשוב להעריך האנטומיה אפידרמיס ופגמים מורפולוגיים בעור מהונדס גנטיעכברים, וכדי לחקור את המנגנונים התאיים ומולקולריים שבבסיס התפתחות אפידרמיס והתחדשות.
המנגנונים הרגולטוריים שליטת פיתוח הומאוסטזיס עור נלמדים הנפוץ ביותר 2D באמצעות חתך רקמות מכתים היסטולוגית או תיוג עם נוגדנים, המאפשר רק הערכה מוגבלת של מורפולוגיה עור, אוכלוסיות תאים או ביטוי חלבון. מספר שיטות פותחו כדי לשפר את להדמיה של הארגון המרחבי של תאים וחלבונ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים אוסטרליים ביו-משאבים (Garvan מכון, אוסטרליה), מרכז המשאבים הביולוגי (אוסטרליה UNSW) ואת הטיפול בבעלי החיים & ועדת אתיקה לתמיכה בניסויים בבעלי חיים. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למחקר בריאות הרפואית של אוסטרליה (פרויקט גרנט APP1062720). ד"ר סזאר פ Canales הוא מקבלי מלגה צ'ילה CONICYT-Becas (# 72,101,076). מר באסם Akladios היא כלת פרס לתארים מתקדמים הבינלאומי של אוניברסיטת ידי UNSW אוסטרליה.
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Urea | Merck Millipore | 66612 | |
2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |