הפעילות האנזימטית מתרחשת של לקטאז חיוני קטבולי עיבוד דו-סוכר חלב (לקטוז). כאן, הפעילות של לקטאז נמצאו ב תוספי מזון הוא לבדיקה באמצעות וזמינותו של ערכי צבע מוחלטים. הדבר מספק לתלמידים פלטפורמה ניסיוני להבנת הפעילות של קינטיקה לקטאז, אנזים.
להבין איך עובדים אנזימים, הנוגעים זה דוגמאות בחיים האמיתיים, הינה קריטית מגוון רחב של דרגות לתואר ראשון במדעי ביולוגי וביו. זה קל לעקוב אחר הפרוטוקול פותחה עבור סטודנטים לתואר ראשון בית מרקחת בשנה הראשונה ומספק מבוא ברמה התחלתית אנזים תגובות ונהלים אנליטי עבור ניתוח האנזים. האנזים של הבחירה היא? לקטאז, כמו זה מייצג דוגמה של אנזים זמינים מסחרית הרלוונטיים לאימון המחלה האנושית/פרמצבטיקה. לקטאז מופק תוסף תזונה טבליות, העריך שימוש assay ערכי צבע מוחלטים בהתבסס על הידרוליזה של סובסטרט מלאכותי של לקטאז (אורתופדיה-nitrophenol –beta-D-galactopyranoside, ONPG). שחרורו של אורתופדיה-nitrophenol בעקבות את המחשוף hydrolytic של ONPG על ידי לקטאז נמדד על ידי שינוי ספיגת-420 ננומטר, ואת השפעת הטמפרטורה על התגובה אנזימטי מוערך על-ידי ביצוע התגובה על קרח, בטמפרטורת החדר ו- 37 מעלות צלזיוס. ניתוח מתקדם יותר ניתן ליישום בעזרת פרוטוקול זה על ידי הערכת הפעילות אנזים בתנאים שונים באמצעות נוגדנים שונים.
אנזימים הם סוג מיוחד של חלבון זה לשמש זרזים ביולוגיים עבור תגובות כימיות חי אורגניזמים1. הפעולה של אנזימים חיונית לחיים, לאספקת אנרגיה, סילוק פסולת, ומאפשר אורגניזמים לתפקד. ההבנה אנזימים, לפיכך, הוא קריטי עבור הבנה מלאה של החיים. ידע כזה חיוני עבור מגוון רחב של תוכניות ברמת תואר באוניברסיטה, החל מדעי הרפואה לביולוגיה. בעוד רקע מפורט ועד עקרונות זרז מודלים תיאורטיים של פעילות אנזים יכולה להינתן לתלמידים באמצעות הרצאות, חומר קריאה, המאפיינים של אנזים תגובות הכי מובנת על ידי ידיים על ניסיון מעשי של אנזימים בפעולה כאמור הפגינו2. פרוטוקול זה מספק פשוט לעקוב פרדיגמה נסיונית למדידת פעילות אנזים בתנאי מעבדה, לקטאז כדוגמא של אנזים עם פעילות הנוגעים לתזונה אנושית ובריאות.
ההידרולז glycosidic לקטאז (EC 3.2.1.23/26) הוא אנזים חשיבות התזונה מרכזית עבור יונקים3. הפעילות של לקטאז מאוד כולו דרך האבולוציה, ונגזרת ממשפחת בטא-galactosidase של אנזימים – משפחה מתנת Escherichia coli דרך הומו ספיינס (איור 1, PDB 1JZ8)4. חשיבות קריטית לקטאז באווירה התזונה האנושית נובעת תפקידה המאפשר פירוק של לקטוז למרכיביו בוחרים חד-סוכר, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש ליצירת אנרגיה בגוף. לקטאז ה מזרז הידרוליזה של קשר גליקוזידי ב דו-סוכר חלב (לקטוז), שחרור גלקטוז וגלוקוז (איור 2)5. Monosaccharides אלה משמשים אז בעיקר לדור של אדנוזין טריפוספט (ATP) דרך מעגל קרבס, זרחון חמצוני6. במהלך neonate והתפתחות תינוקות, לקטאז מתבטאת במיוחד מערכת העיכול האנושית, פירוק לקטוז קיבל חלב של לקטוז אילו הוא הרכיב העיקרי פחמימות, ואחד מקורות מרכזיים של תזונה במהלך השנים הראשונות 7. החשיבות הרפואית של לקטאז מודגשת על ידי מולדת לקטאז (המחלקה לחקירות), מצב נדיר הקרים autosomal נגרמת על ידי מוטציות בגן לקטאז (LCT) קידוד האנזים לקטאז8. תינוק בן יומו תינוקות עם המחלקה לחקירות להפגין מעט מאוד פעילות לקטאז, ובכך הם אינו ניתן להזנה על חלב אם, בכל סוג אחר של חלב, או נוסחה המכילה לקטוז.
במהלך הילדות, ביטוי לקטאז מוקטן בדרך כלל; עם זאת, הפחתה זו בעקבות הגמילה משתנה מבחינה גיאוגרפית, כ- 35% של מבוגרים ברחבי העולם ממשיכים להביע את האנזים9. ביטוי מתמשכת של לקטאז, המכונה התמדת לקטאז, מאפשר ליחידים להמשיך לעכל חלב ומוצרי חלב ממגוון מקורות. לעומת זאת, האובדן של לקטאז הביטוי יכול להוביל אי סבילות ללקטוז, המכונה גם למבוגרים hypolactasia (ATH), הנובע חוסר היכולת לפרק לקטוז בבטן. ATH מאופיין על ידי תהליך בנייה למעלה של לקטוז במעי הגס מבליעת לקטוז המכילה מוצרי מזון. במעי הגס, מותסס של לקטוז שנצבר על ידי החי והצומח מיקרוביאלית מעיים, שחרור גזים כולל מימן, מתאן, הפחמן הדו-חמצני. הייצור של גזים אלה אצל אנשים עם ליקויים האנזים לקטאז לקדם נפיחות בבטן, גזים מוגברת, כאב, בחילות, ו- borborygmi (הבטן מקרקרת)7. רמות גבוהות של לקטוז במערכת העיכול יכול גם להוביל שרפרפים רופף.
השליטה של ביטוי גנים LCT הוא מווסת על ידי פולימורפיזמים ממוקם ב אינטרונים של הגן MCM6 הסמוך. אנשים עם ביטוי מתמשכת של לקטאז לשאת פולימורפיזמים המתפקדים חזקה דיסטלי מרחיבי LCT ביטוי גנים, ובכך קיזוז הרגיל למטה רגולציה של שעתוק LCT במהלך הגמילה, וכתוצאה מכך ביטוי לקטאז מתפעל לבגרות3. משפר פולימורפיזמים שהוצעו חיובי שבחרו בעקבות הביות של בקר וגמלים במזרח התיכון לפני חמשת אלפים שנה9,10.
ניתן לנהל את הסימפטומים הנובעים ATH על-ידי הפחתת צריכת חלב (לקטוז), לדוגמה על-ידי הסרת מוצרי חלב בתזונה. גישה חלופית עבור ATH, הגישה של בחירה עבור המחלקה לחקירות, הוא השימוש של תוספי לקטאז, זמין נרחב מבתי מרקחת. תוספות אלה מספקים לקטאז מבודד ממגוון רחב של מקורות, כולל שמרים וחיידקים, בצורה נוזלית או מבוסס-הגלולה שניתן לקחת עם או להוסיף מזון המכיל לקטוז. תוספת hydrolyze שיעור של לקטוז נוכח המזון למוצרים גלוקוז, גלקטוז, ובכך יאפשר לקליטתם ומניעת הצטברות של לקטוז מעוכל המצע בבטן.
בהתבסס על השימוש של תוספי לקטאז כסיוע תזונתיים, פיתחנו ניסוי מעבדה אנזימולוגיה פשוט מתאים לתלמידי השנה הראשונה ביו המדע או בית מרקחת. בניסוי מעבדה מנצל תוספי לקטאז זמינים מסחרית, והשימושים אורתופדיה-nitrophenol –beta-D-galactopyranoside (ONPG) כדי לספק נקודת סיום ערכי צבע מוחלטים למדידת המחשוף של איגרות חוב glycosidic על ידי לקטאז ( איור 3)11. ONPG פועל על סובסטרט מלאכותי עבור? לקטאז, אשר כאשר נתון הידרוליזה על ידי אנזים זה מייצר D-גלקטוז אורתופדיה-nitrophenol. המוצר האחרון בעל צבע צהוב, קליטת אור באורך-גל של 420 ננומטר. מאת לכימות שינויים כלשהם ספיגת-420 nm הבאים חשיפת ONPG לקטאז, זה אפשרי להעריך את הפעילות של אנזים זה. בניסוי מעבדה מספק הפגנה של פעילות ההידרולז אנזימטיות. על ידי בבניין משכפל נוסף, בביצוע מבחני בתנאים שונים, זה ניתן לשלב ניתוח מתוחכמות יותר של קינטיקה אנזימטית, מתן דוגמה ממשית ערך של אנזימים בפעולה הרלוונטיים לבריאות האדם.
נתונים היסטוריים הידע וההבנה של אנזימים, תגובות אנזימטיות, קינטיקה אנזימטית נדרש עבור מגוון רחב של נושאים המתפרסות על-פני הביולוגיה, וההתערבות ו פרמקולוגיה. הפרוטוקול המתואר לעיל משתמש לקטאז כדוגמה של אנזים הרלוונטיים לבריאות האדם על הפגנת אנזימטיות, מתן מפתח מיומנויות שיכול לשמש בניסויים מבוסס מעבדה מתקדמים יותר.
פרוטוקול זה תוכנן בכוונה להיות הכי חזקים כמו אפשרי, דבר המאפשר לתלמידים עם מעט או ללא ניסיון מעבדה רטוב לתוצאות interpretable בזמן קצר של זמן. בשנת 2014/2015 הלימודים בביה ס מאוניברסיטת רדינג של בית מרקחת, סך של 144 סטודנטים, מאורגנת בקבוצות של 3, ביצעו את הניסוי “מדידת לקטאז”, עם מסוגלים לזהות רמה מסוימת של פעילות אנזימטי של לקטאז tablet כל הקבוצות תמציות.
ישנם מספר צעדים קריטיים של פרוטוקול זה. קודם כל, זה חיוני כי החילוץ הראשוני הוא יעיל, ומאפשר solubilization של האנזים פעיל מספיק עבור ניתוחים שלאחר מכן. מניסיוננו, בשנה הראשונה סטודנטים ניתן להשיג זאת על-ידי ביצוע הפרוטוקול כמתואר; עם זאת הדרכה של מפגינים מעבדה נדרשה בשלב זה. למרות נראה נקודה מובנת מאליה, אחד מגורמי ההצלחה של פרוטוקול זה הוא היכולת למדוד באמצעי אחסון, כראוי בתווית צינורות ובזהירות ההוראות. בעוד רמה מסוימת של מיומנות ניתן להניח עבור סטודנטים רבים, פיקוח קפדני, בקשה ברורה לתלמידים לבקש סיוע בכל מקרה שבו הם בטוחים מה לעשות הבא מספק את הסבירות הגדולה ביותר של assay מוצלחת.
הערכת התלמיד יכול להתבצע על ידי ב- class בגליון העבודה (זמין כחומר משלים), מבקשים התלמידים לציין נתוני הניסויים, תגובה על התוצאות שלהם קישור לקריאת/רקע מידע מחומר ההרצאות, או יותר מפורט, מתוך הערכה בכיתה עם מודל נתונים שסופקו המאפשר ניתוח קינטי להיות ניסיון ולא מוערכים.
פרוטוקול שהוצגו במסמך זה הוא דוגמה פשוטה assay פעילות לקטאז תחת תנאי מעבדה מלמד, קואנקה כדי להגדיל את המורכבות של הניסוי כדי לאפשר ניתוח מתקדם יותר. בפרט, פרוטוקול שהוצגו מספקת מבוא לרעיון של קינטיקה אנזימטית אך אינו מאפשר ניתוח קינטי של נתוני הניסוי. ככזה, אנו ממליצים לצפייה הפרוטוקול המתואר כמו תבנית הראשוני עבור מחלקות, עם הפרטים המדויקים הותאם שיתאים את מטרות ספציפיות ואת כישוריו של קבוצה סטודנט התחייבות הניסויים. דוגמאות לניסויים המורחבת יכול לכלול: לחזור על המדידות בטמפרטורות שונות, באמצעות ריכוז סובסטרט שונים כדי לאפשר ניתוח סטטיסטי, קינטי ניתוח של נתונים (מתאים עבור סטודנטים ביוכימיה/מקצועות ראשיים), החל מספר לוחות שונים, המאפשר את התלמידים להעריך את פעילות שונים של האנזים בכל אחד (עם התוספת של שליטה טבליות, מתאים למדע פורנזי סטודנטים/מקצועות ראשיים), הערכת ההשפעה של חום דנטורציה או נושאת את המתחרים ניסויים על-ידי תוספת של לקטוז או מעכבים של לקטאז (טבלה 1). פרוטוקול מפורט לניתוח קינטי של לקטאז בעבר כבר פורסם12.
כוח חשוב של פרוטוקול זה הוא כי הוא משלב הקדמה בסיסי קינטיקה אנזימולוגיה, האנזים עם חקר מקרה אמיתי של אנזימולוגיה ברפואה. זה הופך את המעבדה. ניסוי הרלוונטיות לסטודנטים לרפואה, בית מרקחת, ביו ונושאים קשורים נוספים. חשוב מכך, העובדה כי יש בעיה רפואית רצינית וגם בעיית תזונה נפוצה יותר המשויכים לקטוז קטבוליזם מספק הזדמנות להעלות מגוון רחב של בעיות רפואיות ואתיות עם התלמידים. זה יכול לכלול את הנושאים בדיקה גנטית לטיפול בבעיות רפואיות, הקשורים דיונים הנוגעים ריפוי גנטי ייעוץ גנטי, כמו גם שימוש ואת מכירת צמחי מרפא תוספי מזון. מגבלה אחת גדולה היא כי הפרוטוקול אינו מאפשר הערכה מדויקת של ריכוז אנזים, עקב החומר ההתחלתי המשמש להפקת. שינוי להביא בחשבון זה, עם זאת, יהיה לשימוש ריאגנט כיתה אנזים וזמינותו. חשוב, זה יאפשר גם לחישוב מדויק יותר של קינטיקה של האנזים לקטאז.
לסיכום, assaying את הפעילות של לקטאז במעבדת ההוראה מספק סביבה חזקים, מרתק ומעניין הקדמה השדה של ביולוגיה אנזים בשלב מוקדם סטודנטים.
The authors have nothing to disclose.
חבר מומן על ידי בריטניה מחקר לאגודה פרקינסון (גרנט F1002). עבודה זו נתמכה על ידי MRC החדש החוקר במענק מחקר (מר/L010933/1), על-ידי תוכנית MRC להעניק מר/N026004/1 ל- PAL, ועל ידי BBSRC studentship BB/M017222/1 למטוס. אנו מודים על עוקבה 2014-15 של MPharm חלק 1 סטודנטים מאוניברסיטת רדינג עבור השתתפות איטרציה הראשון של גדודים הזה מעשי, ובעקבות משוב, קלט.
Lactase tablet | Lamberts | 8511-60 | |
Phosphate buffered saline (powdered) | Sigma | P3813 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 100 mM |
ONPG | Sigma | N1127 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 5 mM |
Sodium Carbonate | Sigma | 451614 | Dissolved in deionized water to a final concentration of 1 M |
De-ionized water | NA | NA | |
Pestle and mortar | VWR | ||
Spectrophotometer | Jenway 6315 | ||
Pipettes | Gilson | ||
15 mL tubes | VWR | ||
1.5 mL tubes | Eppendorf | ||
Spectrophotometer cuvettes | Jenway | ||
Vortex | Vortex genie 2 | ||
Centrifuge | Beckman | ||
Ice bucket | VWR | ||
Water bath | Thermo-Scientific | ||
Weighing scales | Thermo-Scientific |