Эта рукопись обеспечивает техническую процедуру , которая может быть использована для характеристики культур C1498 клеток в пробирке и острый лейкоз , индуцированного у мышей после их инъекции. Фенотипические и функциональные анализы выполняются с помощью проточной цитометрии, иммунофлюоресценции микроскопии, цитохимических и Май-Грюнвальд Giemsa окрашивания.
Внутривенная инъекция C1498 клеток в сингенных или конгенных мышей было проведено с 1941. Эти инъекции приводят к развитию острого лейкоза. Тем не менее, природа этого заболевания не была хорошо описана в литературе. Здесь мы предоставляем технический протокол для характеристики клеток C1498 в пробирке и для определения характера индуцированного лейкоза в естественных условиях. Первая часть этой процедуры сосредоточена на определении кроветворную происхождение и стадию дифференцировки культивированных клеток C1498. Для достижения этой цели, многопараметрических проточной цитометрии окрашивания используется для обнаружения маркеров кроветворных клеток. Иммунофлуоресценции микроскопии, цитохимия и окрашивающий Май-Грюнвальд Гимза затем выполняется для оценки экспрессии миелопероксидазы, активность эстеразы и клеточной морфологии, соответственно. Вторая часть этого протокола посвящена описанию болезни лейкемии , которая индуцируется вестественных условиях. Последнее может быть достигнуто путем определения частот лейкозных и присущих клеток в крови, кроветворных органов (например, костного мозга и селезенки) и не лимфоидных тканей (например, печень и легкие) с использованием специфических окрашивания и проточной цитометрии анализа. Характер лейкоза затем подтверждена с помощью Май-Грюнвальд Giemsa окрашивания и окрашивания для специфических эстераз в костном мозге. Здесь мы приведем результаты, которые были получены с использованием этого протокола в подобранных по возрасту C1498- и PBS-инъецированных мышей.
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) характеризуется неконтролируемой пролиферации гемопоэтических миелоидных клеток, которые блокируются на разных стадиях созревания. Это дисрегуляция может повлиять на гранулоцитарного, моноцитарного, эритроцитарного или megaryocytic путей дифференцировки 1. AML клетки накапливаются в костном мозге, что приводит к нарушению гемопоэза, что приводит к тромбопения, лимфопении и анемии. Лейкозных клеток также проникают в кровь и не-лимфоидных органов.
Модель C1498 мышь была использована в течение многих десятилетий в качестве модели для острого лейкоза , так как раковые клетки были выделены из лейкозных 10-месячного C57BL / 6 (H-2 б) самки мыши в 1941 году В литературе описаны вторжение в кровь , кроветворные органы (например, селезенки и лимфатических узлов) и не кроветворные органы (например, печень, легкие, яичники, почки) по высоко пролиферирующих C1498 после того, как они были введены через инtravenous, подкожное или внутрибрюшинно в восприимчивых мышей 2-4. Тем не менее, было сообщено эта модель мыши , чтобы вызвать либо гранулоцитарный 2,5 или миеломоноцитарным 6 лейкоз. Совсем недавно, в исследовании , опубликованном в 2002 году описал этот тип рака , как мышиный НКТ клеточный лейкоз 7. Таким образом, литература отличается относительно природы этой клеточной линии C1498 и связанный с лейкемией он индуцирует у мышей. Эти расхождения в основном из-за отсутствия подробной и обновленной опубликованной информации о клетках и лейкозных заболевания в целом, так как многие исследования были проведены в 1950 – 70-х годов.
Здесь мы предлагаем подробный протокол для описания того, чтобы охарактеризовать клетки C1498 и проанализировать природу лейкозных болезни, индуцированной их внутривенной инъекции в организм мышей. Первый раздел этого протокола посвящен описанию C1498 клеток, которые культивировали в пробирке. Флуоресцентные антитела, направленные против поверхностных и внутриклеточных гемопоэтических маркеров использовались для определения их фенотипа с использованием проточной цитометрии. Присутствие миелопероксидазы оценивали с помощью иммунофлюоресценции микроскопии, их гемопоэтические происхождение и степень дифференцировки, были оценены с использованием цитохимических для оценки активности эстераз, и Май-Грюнвальд Гимза проводили окрашивание. Клетки C1498 затем вводили мышам, и острое заболевание лейкоз, который индуцировали описан во второй части этой статьи. Те же методы были использованы для определения частоты и фенотипы лейкозных и присущих клеток в костном мозге, периферической крови, селезенки и некроветворных органов (печени и легких).
Этот протокол является очень воспроизводимые, и данные, представленные здесь, помогут исследователям оценить влияние новых терапевтических стратегий. Эта модель лейкемии мыши уже используется для тестирования иммунотерапия приближается кй различные препараты химиотерапевтические 8,9. Их эффективность оценивали путем определения эволюции опухолевой массы и выживаемости. Этот протокол может быть использован для предоставления дополнительной информации о распределении и существования популяций лейкозных и других гемопоэтических клеток во время лечения.
В предыдущих исследованиях C1498 линия клеток была описана как индуктор острого гранулоцитарного 5, миеломоноцитарным 6 или НКТ 7 клеток лейкемии. Тем не менее, показательные данные в литературе были либо отсутствуют, либо неполна. Протокол, представленные здесь, используются различные методы, такие как проточной цитометрии, иммунофлюоресценции, МГГ окрашивания и цитохимических анализов для характеристики культивируемых клеток C1498 и определить характер лейкоза, индуцированный у мышей после их вводят.
Когда мы phenotyped в пробирке культивировали C1498 клеток после иммунным окрашиванием и проточной цитометрии проводили анализы, мы наблюдали некоторые ограничения , так как эти клетки экспрессируют несколько маркеров гемопоэтических клеточной поверхности , которые были ранее описаны в литературе , 6,7. В соответствии с нашими результатами, Лабелль и др. Не наблюдали экспрессию клеточной поверхности зрелого TCR на C1498 клеток с использованием cytomet потокачень окрашивание. Тем не менее, они считали их быть НКТ клеточную линию после того, как они обнаружили CD3ε и TCRVβ8.2 7 мРНК. Мы также наблюдали внутриклеточной экспрессии TCRVβ цепей и молекул CD3ε в большинстве клеток (> 70%), но их гематопоэтических клонов не может быть определено, потому что было также сопутствующее внутриклеточную экспрессию молекулы MAC-3.
Миелопероксидазы, МГГ окрашивание и оценки для анализа функциональных эстеразы с использованием ЦИТОХИМИЯ показал, что C1498 клеточная линия имела миелоидного происхождения и состоит из монобласт и миелобластов. Эти результаты были согласные с процентом MAC-3 + клетки , которые были получены в проточной цитометрии анализа окрашивание. Хотя это и не количественное, эти шаги представляют собой ключевые эксперименты, которые будут выполнены. На самом деле, они остаются, до сих пор, наилучшие существующие методы, характеризующие происхождение и степень дифференцировки гемопоэтических клеток, которые выражают отсутствие или пРЭБ специфические маркеры фенотипические.
Проточная цитометрия окрашивания было полезно для демонстрации развития острой лейкемии у мышей после конгенных C1498 клетки внутривенно вводили. В CD45.2 + C1498 клетки , которые проникали в периферической крови и различных органах были изолированы, и были определены их частоты. Количественное также была проведена для анализа присущей медуллярной и клеток селезенки после иммунофенотипирования. Ограничения были обнаружены , когда фенотип C1498 клеток исследовали в органах , как они выражены несколько гемопоэтических маркеров (лишь немногие из них были B220 +). Для того, чтобы определить характер наблюдаемого острого лейкоза, май-Грюнвальд Giemsa окрашивания и анализ деятельности моноцитов и гранулоцитов эстераз проводили с использованием костного мозга. Результаты показали, что C1498 клетки сохранили свою миелобластный и монобластный морфологии и функции, открывая начало миеломоноцитцарный лейкемии.
<p class = "jove_content"> При рассмотрении для критических шагов, описанных в данном протоколе, особое внимание следует уделить рН при выполнении цитохимических реакций и МГГ окрашивания, так как ошибки в рН может привести к неверной интерпретации результатов. Например, α-нафтил бутират эстеразы активность специфично для моноцитов только при рН 6,0, так как гранулоциты и лимфоциты также могут испачкать положительным для этого испытания при более высоких значениях рН. Фиксируете клетки не рекомендуется перед проведением МГГ окрашивания, и мы показали, что только при условии фиксации CAF удовлетворительные результаты при выполнении эстераз цитохимических реакций с использованием C1498 клеток. Чтобы сохранить экспрессию молекулы CD115 и его обнаружение с помощью проточной цитометрии, как все образцы (например, кровь, костный мозг, и клетки селезенки) должны храниться на льду во время процедуры. Если нет окрашивания не наблюдается в проточной цитометрии или / и экспериментов иммунофлюоресценции, ссылки антител, их хранение повторнопохвал и их разведения должны быть проверены. Ссылки, указанные в таблице материалы / оборудование были выбраны для проточной цитометрии или иммунофлюоресценции приложений. Первичные / вторичные антитела или их сопряженными флуорофоры , возможно, потеряли свою активность из – за неправильного хранения (например, воздействием света или тепла), неправильного разбавления, обширные замораживания / оттаивания или использование загрязненных буферов. Запуск положительного контроля, чтобы убедиться, что они работают должным образом. С помощью мыши костного мозга или селезенки полученных клеток, которые, как известно, экспрессировать белки, представляющие интерес. Для того, чтобы избежать высокого фона и неспецифическое окрашивание, убедитесь, что клетки промывают должным образом и выдерживают при высокой влажности (для иммунофлуоресценции) и что антитела разводят в соответствии с инструкцией. С помощью той же концентрации и разбавления для контроля изотипа антитела и первичного антитела, чтобы точно определить уровень фона в образце. Для эстеразы ЦИТОХИМИЯ экспериментовРеагенты могут быть протестированы с помощью положительных и отрицательных слайдов управления , содержащие очищенный мыши селезеночной гранулоцитарного (Ly6G +) и моноцитарного (+ CD115) клеток.Процедура , описанная в данном исследовании показали , что многие из лейкозных особенностей , наблюдаемых у мышей после инъекции C1498 клеток имеют общие признаки с человеческим острым лейкозом миеломоноцитцарный 11,12. Инфильтрации лейкозных клеток приводит к уменьшению зрелых и незрелых клеток-предшественников (прекурсоров) и сердцевинные кроветворных клеток. C1498 клетки присутствуют на высокой частоте (> 20%) в периферической крови, как и моноцитов. Гепатомегалии и спленомегалии наблюдались в результате инфильтрации лейкозных клеток, а также наблюдали значительное увеличение В-лимфоцитов и миелоидных клеток, чтобы сопровождать спленомегалии. Тромбопения также наблюдалось, когда количество тромбоцитов в крови были оценены с использованием гематологического анализатора.
Это было шоуп, используя в экспериментах пробирке, что C1498 клетки подавляют нормальную мышиную кроветворение секрецией растворимых факторов 13. В некоторых моделях опухолей мышей, незрелых миелоидных клеток ( в том числе моноцитов и гранулоцитов), также было показано , чтобы мигрировать из костного мозга в селезенке, где они ингибируют противоопухолевый специфической активации Т – клеток и пролиферацию 14. Таким образом, снижение кроветворных клеток, которые наблюдали в костном мозге может быть результатом либо недостатка в кроветворении, и / или из их эмиграции. Этот последний механизм мог бы объяснить наличие моноцитоз в периферической крови или наблюдение за увеличенных миелоидных фракций в селезенке. Можно также предположить, что эти клетки могут быть получены из улучшенной селезеночного кроветворения. Действительно, в стационарных условиях, некоторые подмножества селезеночных В – клеток были идентифицированы как предшественники зрелых В – лимфоцитов 15. Кроме того, при воспалительных состояниях, медullary стволовых и предшественниках клеток было показано , переместить в селезенке , чтобы индуцировать образование зрелых моноцитов 16. Этот протокол не позволяет сделать выводы относительно механизмов, которые участвуют в развитии лейкемии, а также дополнительные функциональные, а также молекулярные анализы должны быть использованы, чтобы сделать это. Тем не менее, эти данные включают в себя подробную информацию о клинических признаках острой лейкемии миеломоноцитцарный и поможет исследователям оценить и понять последствия новых терапевтических агентов.
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the “Ligue Nationale contre le Cancer” (Comité du Septentrion), the SIRIC ONCOLille (Grant INCa-DGOS-INSERM 6041) and the Institut pour la Recherche sur le Cancer de Lille (IRCL) for supporting this work. They would like to thank Delphine Taillieu and the animal facility staff for housing the mice and maintaining their welfare. We also thank Raphaëlle Caillerez and Nathalie Jouy for their respective help in microscopy and flow cytometry.
C1498 cell line | ATCC | TIB 49 | |
C57BL/6J-Ly5.1 | Charles River | B6.SJL-Ptprc a Pep3 b/BoyCrl | |
Cells culture reagents | |||
2-Mercaptoethanol, Gibco | ThermoFisher Scientific | 21985 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10270 | |
HEPES, Gibco (1 M) | ThermoFisher Scientific | 15630 | |
Non-Essential Amino Acids Solution, Gibco | ThermoFisher Scientific | 11140 | |
Penicillin-Streptomycin, Gibco | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
RPMI 1640 Medium (Gibco, GlutaMAX Supplement) | ThermoFisher Scientific | 61870 | |
Sodium Pyruvate, Gibco (100 mM) | ThermoFisher Scientific | 11360 | |
Flow cytometry staining reagents | |||
anti-mouse B220 APC (1) | ebiosciences | 17-0452 | clone RA3-6B2, final dilution 1/100 |
anti-mouse B220 biotin (2) | ebiosciences | 13-0452 | clone RA3-6B2, 1/400 |
anti-mouse CD3 eFluor450 (1) | ebiosciences | 48-0032 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE (2) | BD biosciences | 555275 | clone 17A2, 1/100 |
anti-mouse CD3 PE-Cy5 (3) | ebiosciences | 15-0031 | clone 145-2C11, 1/100 |
anti-mouse CD4 APC (1) | ebiosciences | 17-0041 | clone GK1.5, 1/500 |
anti-mouse CD4 PE (2) | ebiosciences | 12-0041 | clone GK1.5, 1/200 |
anti-mouse CD8 biotin (1) | ebiosciences | 13-0081 | clone 53-6.7, 1/100 |
anti-mouse CD8 eFluor450 (2) | ebiosciences | 48-0081 | clone 53-6.7, 1/500 |
anti-mouse CD11a biotin | ebiosciences | 13-0111 | clone M17/4, 1/100 |
anti-mouse CD11b PE | ebiosciences | 12-0112 | clone M1/70, 1/200 |
anti-mouse CD16/32 biotin | ebiosciences | 13-0161 | clone 93, 1/400 |
purified anti-mouse CD16/32 (FcR blocking) | BD biosciences | 553141 | clone 2.4G2 |
anti-mouse CD18 biotin (1) | ebiosciences | 13-0181 | clone M18/2, 1/100 |
anti-mouse CD18 FITC (2) | ebiosciences | 11-0181 | clone M18/2, 1/50 |
anti-mouse CD19 PE | ebiosciences | 12-0193 | clone 1D3, 1/200 |
anti-mouse CD21/35 PE | ebiosciences | 12-0211 | clone 8D9, 1/50 |
anti-mouse CD31 PE | ebiosciences | 12-0311 | clone 390, 1/100 |
anti-mouse CD34 eFluor660 | ebiosciences | 50-0341 | clone RAM34, 1/20 |
anti-mouse CD44 PE | BD biosciences | 553134 | clone IM7, 1/50 |
anti-mouse CD45.2 FITC | ebiosciences | 11-0454 | clone 104, 1/100 |
anti-mouse CD49b/Pan NK PE | BD biosciences | 553858 | clone DX5, 1/50 |
anti-mouse CD80 biotin | ebiosciences | 13-0801 | clone 16-10A1, 1/200 |
anti-mouse CD86 biotin | ebiosciences | 13-0862 | clone GL1, 1/200 |
anti-mouse CD107b (Mac-3) PE | ebiosciences | 12-5989 | clone M3/84, 1/40 |
anti-mouse CD115 PE | ebiosciences | 12-1152 | clone AFS98, 1/100 |
anti-mouse CD117 eFluor450 | ebiosciences | 48-1171 | clone 2B8, 1/100 |
anti-mouse CD127 PE | ebiosciences | 12-1271 | clone A7R34, 1/100 |
anti-mouse CD150 APC | ebiosciences | 17-1501 | clone 9D1, 1/20 |
anti-mouse CD274 (PD-L1) biotin | ebiosciences | 13-5982 | clone MIH5, 1/200 |
anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) PE | ebiosciences | 12-5981 | clone D7, 1/100 |
anti-mouse Ly-6C APC | ebiosciences | 17-5932 | clone HK1.4, 1/200 |
anti-mouse Ly-6G (Gr-1) biotin (1) | ebiosciences | 13-5931 | clone RB6-8C5, 1/400 |
anti-mouse Ly-6G FITC (2) | ebiosciences | 11-9668 | clone 1A8, 1/50 |
anti-mouse MHC class I (H-2Db) biotin | ebiosciences | 13-5999 | clone 28-14-8, 1/50 |
anti-mouse MHC class II (I-A/I-E) PE-Cy5 | ebiosciences | 15-5321 | clone M5/114.15.2, 1/1000 |
anti-mouse NK1.1 PE | BD biosciences | 557391 | clone PK136, 1/50 |
anti-mouse TCRVb FITC | BD biosciences | 553170 | clone H57-597, 1/50 |
streptavidin PE-Cy5 | ebiosciences | 15-4317 | 1/200 |
Immunofluorescence staining reagents | |||
Anti-mouse myeloperoxidase (heavy chain antibody) | Santa Cruz Biotechnology | sc-16129 | 1/10 (20 µg/ml) |
anti-goat IgG (Texas Red coupled antibody) | Jackson Immunoresearch | 705-076-147 | 1/250 |
Normal donkey serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-001 | |
Hoechst solution | BD Biosciences | 561908 | 1/1000 |
Mounting medium 1 (Fluoromount) | Sigma-Aldrich | F4680 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
Esterase cytochemical staining reagents | |||
Naphtol AS-D chloroacetate solution | Sigma-Aldrich | 911 | |
Dye solution (Fast Red Violet LB Base solution) | Sigma-Aldrich | 912 | |
pH6.3 buffer concentrate (TRIZMAL) | Sigma-Aldrich | 913 | |
Sodium nitrite solution | Sigma-Aldrich | 914 | |
Citrate solution | Sigma-Aldrich | 915 | |
Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | GHS3 | |
Acetone | VWR | 20066 | |
Formaldehyde solution, 37% | Sigma-Aldrich | F1635 | |
α-naphthyl butyrate solution | Sigma-Aldrich | 1801 | |
Phosphate buffer solution | Sigma-Aldrich | 1805 | |
Sodium nitrite Tablet | Sigma-Aldrich | 1809 | |
Pararosaniline solution | Sigma-Aldrich | 1804 | |
Methylene blue solution | Sigma-Aldrich | 1808 | 1/10 |
mounting medium 2 (Clearmount) | Invitrogen | 00-8010 | |
May-Grünwald Giemsa staining reagents | |||
May-Grünwald solution | RAL Diagnostics | 320070 | |
Giemsa R solution | RAL Diagnostics | 320310 | 1/20 |
pH 6.8 buffer solution | RAL Diagnostics | 330368 | |
Others materials, reagents and equipment | |||
Ketamine 1000 (100 mg/mL) | VIRBAC | 3597132111010 | |
Xylazine SEDAXYLAN (20 mg/mL) | CEVA | ||
Bovin albumin serum (BSA) powder | ThermoFisher Scientific | BP671 | |
PBS solution (1x concentrate) | ThermoFisher Scientific | 14190 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 158127 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
Ultra Pure 0.5 M EDTA solution, pH 8.0 | ThermoFisher Scientific | 15575 | |
Separating solution (Pancoll Mouse) | PANBIOTECH | P04-64100 | |
Lysis buffer (Red Blood Cells Lysing Buffer) (10X) | BD Biosciences | 555899 | 1/10 |
NaOH 10N | ThermoFisher Scientific | SS267 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | ThermoFisher Scientific | 15250-061 | 1/2 |
50 mL tube (Falcon) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
70µm Cell Strainer (Falcon) | Corning Life Sciences | 352350 | |
Chamber & filter card (EZ Cytofunnel Shandon) | Thermo Scientific | A78710003 | |
Microscope Cover Glasses, 24x24mm | Knittel Glass | VD1 2424 Y100 | |
Slides (Starfrost – ground edges 90) | Knittel Glass | VS1137# 077FKB | |
EDTA Tube | Greiner Bio-One | 454034 | |
Pasteur Pipette 150MM (capillary tube) | Fisherbrand | 1154-6963 | |
26G needle | Terumo | NN-2613R | |
insulin syringe and needle 29G | Terumo | BS05M2913 | |
30G needle | Becton & Dickinson | 304000 | |
Flow cytometry tubes (blue) | Beckman Coulter | 2523749 | |
Water-repellent pen (Dakopen) | Dako | S200230 | |
Sharp sterile scissors | Nessi-care | SCI-01 | |
Sterile forceps | Dominique Dutscher | 956506 | |
Thoma cell counting chamber | VWR | 631-0397 | |
Petri Dishes (Fisherbrand Plastic) | ThermoFisher Scientific | S33580A | |
Microcentrifuge tube (1.5 mL) | ThermoFisher Scientific | 05-408-129 | |
Cylindrical Restrainer 15-30 gm | Stoelting | 51338 | |
Shandon Cytospin 3 Cytocentrifuge | ThermoFisher Scientific | ||
10 mL syringe | Terumo | SS-10L | |
1 mL syringe | Terumo | SS-01T | |
Ethanol | Merck | 1.08543 | |
Sterile gauze sponges | URGO | 501580 |