Summary

グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

Published: June 07, 2017
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Summary

マクロファージは、防御免疫およびホメオスタシスにおいて決定的な役割を果たす造血系のプラスチック細胞である。この報告では、寛容原性条件下で移植臓器に蓄積する移植片浸潤調節マクロファージの表現型および機能的特徴付けのための最適化されたインビトロ技術を記載する。

Abstract

移植臓器におけるマクロファージの蓄積は、同種移植拒絶1の特徴として長い間認識されてきた1 。免疫原性単球は、移植後早期に同種移植に浸潤し、移植された器官に対する移植片反応性反応を起こし、臓器拒絶反応を開始する2 。最近のデータは、抑制性マクロファージが長期移植の成功を促進し、移植寛容の誘導に必要であることを示唆している4 。これは、マクロファージ機能の単離および解析のための新しいロードマップを必要とする、マクロファージの個体発生、活性化、および機能の多次元概念を示唆している5 。マクロファージの可塑性のために、組織環境に応じてマクロファージを単離し、特徴づけ、異なるシナリオに従ってその機能を定義する方法論を提供することが必要である。ここでは、グラフト浸潤マクロファージの免疫学的特性決定のためのプロトコルであり、我々がCD8 + T増殖を阻害し、インビトロで CD4 + Foxp3 + Treg増殖を促進する能力を機能的に評価するために使用した方法ある。

Introduction

このプロトコルは、心臓同種移植片から単離された組織浸潤マクロファージの機能を、T細胞応答を調節するそれらの能力に従って研究するためのインビトロ技術を記載する。文献に広く記載されているように、フローサイトメトリーと組み合わせた蛍光細胞追跡色素は、インビトロおよびインビボでの特定の細胞型の抑制機能を研究する強力なツールである。我々のプロトコルは、インビトロでリンパ球増殖をモニターするためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)法に従う。

CFSE標識細胞が分裂すると、その子孫はカルボキシフルオレセイン標識分子の半分の数を獲得する6 。フローサイトメトリーによる細胞蛍光の対応する減少を用いて、T細胞免疫応答を調節するための抑制性マクロファージの能力をモニターして、細胞分裂を評価することができる。 CFSEはフルオレセインベースの色素であるため、それはbr多色フローサイトメトリーに適用できるようにする。過剰なスペクトルの重複および抗体陽性細胞、特にCFSE7のような可視タンパク質色素を認識できないことを避けるために、表現型決定のための蛍光色素の適切な選択もまた重要である。

放射性標識チミジン(TdR) 8を使用するチミジン取り込みアッセイのような、細胞増殖を測定する別の技術よりも蛍光色素を用いることの多くの利点がある。このアッセイは、有糸分裂細胞分裂中に染色体DNAの新しい鎖に組み込まれるトリチウム化チミジン( 3 H-TdR)を利用する。細胞分裂の程度を決定するために、細胞から回収されたDNA中の放射能を測定するために、シンチレーションベータカウンターが使用されるので、このアッセイに関連する安全性の懸念は放射性同位体の使用である。方法論的には、トリチウム化チミジン尻細胞の数が少なく、染色後に分析が遅れるなど、重要な臨床検査室の制約条件を満たすほど柔軟ではありません。これとは対照的に、CFSE染色は、細胞増殖を防止し、CD69、HLA-DRおよびCD25などの重要な活性化マーカーを妨害することが示されている。したがって、それぞれの方法論の利点と限界を理解することは、特に、異なる細胞タイプを追跡するために複数の色素が使用される多色検査では、正確で再現性のある結果を得るために重要です。

Protocol

この研究では、マウスは、米国農務省のガイドラインおよび実験動物のケアおよび使用のための公衆衛生サービスガイドの勧告に従って収容されている。動物使用を含むすべての実験的技術は、Mount Sinai School of MedicineのIACUC(Institutional Animal Care and Utilization Committee)承認プロトコールに従って実施した。 1.メディアの準備 2mMのL-グルタミン、1mMのピルビン酸?…

Representative Results

代表的な結果は、上記のプロトコルで説明されているゲーティング戦略を示しています。結果はまた、移植片浸潤マクロファージとの共培養後のT細胞増殖活性の分析を示す。マクロファージサブセットのin vitro抑制能力を図4で分析した。結果は、寛容化されたレシピエントから得られたLy6C lo Ly6G -マクロファージが抑制的であるこ?…

Discussion

このプロトコルは、異なるネズミ実験モデルの他の組織にも適用可能な、実験的なネズミ移植モデルの移植片浸潤骨髄細胞サブセットを免疫学的に特性化するために使用した方法を記載している。純粋な細胞サブセットの良好な収率を単離するためには、20psiでの低圧細胞ソーティングが好ましい方法でした。異なる骨髄集団間の抑制能力の決定的な結果を確立するためには、各骨髄サブセ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

我々は、フローサイトメトリー、顕微手術、およびシナイ山での研究優秀な生物リポジトリ/病理学のセンターの技術的貢献を認めています。この研究は、COST Action BM1305:細胞致死療法(A FACTT)、Mount Sinai Recanati / Miller Transplantation Instituteの開発基金、Ciencia e Innovacion Minister SAF2013-48834-RおよびSAF2016-80031-Rに焦点を当てて加速するアクションJO

Materials

RPMI 1640 Media Life Technologies 11875119
10 % FBS Life Technologies 26140-079
1000X 2-mercaptoethanol Life Technologies 21985023
100X Pen/Strep Life Technologies 15140122
100X L-glutamine Life Technologies 25030081
100X Non Esential amino acids Corning 25025039
1M HEPES buffer  Corning 25060CL
100mM Sodium Pyruvate ThermoScientific SH30239.01
Penicilin/Streptavidyn ThermoScientific 15140122
Collagenese A Roche 70381322
DPBS (w/o calcium&magnesium) Corning 21031CV
70 micron Cell strainer Fisher 22363548
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01
DAPI Sigma 32670-5mg-F
CFSE-FITC Invitrogen C34554
Dynabeads Mouse T cell activator CD3/CD28 Life Technologies 11452D
96 well  U-bottom plate Corning 353077
Antibodies:
anti-Ly6C-APC eBioscience 175932-80
anti-Ly6G-Pe/Cy7 Biolegend 127617
anti-CD11b-Percp/Cy5.5 eBioscience 45011282
anti-CD45-APC/Cy7 eBioscience 47045182
anti-CD4-APC eBioscience 17004181
anti-CD8-P/ Cy7 eBioscience 25008181
LSRII Flow Cytometer BD Bioscience
FACSDiva Software BD Bioscience
C57BL/6-Foxp3tm1Flv/J  The Jackson Laboratory 008374
C57BL/6 The Jackson Laboratory 000664
Balb/c The Jackson Laboratory 000651

References

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Cite This Article
Ochando, J., Conde, P. Functional Characterization of Regulatory Macrophages That Inhibit Graft-reactive Immunity. J. Vis. Exp. (124), e54242, doi:10.3791/54242 (2017).

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