Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten.
The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.
Vaccinia-Virus (VV) ist ein umhülltes DNA-Virus auf die Pockenvirus-Familie gehört und hat eine entscheidende Rolle in einer der größten Erfolge in der Medizin der Ausrottung der Pocken gespielt. In der post-Eradikation Ära der Pocken, VV zur Abgabe von Genen , die für Impfstoffe gegen HIV und andere Infektionskrankheiten als Vektor entwickelt 1-7 durch Einfügen von Genen aus verschiedenen Pathogenen in VV – Vektoren wurde. VV wurde auch als Vektor für die Krebsimmuntherapie 8-14 speziell für die Entwicklung von Tumor-bezogenen replizierende onkolytischen Vacciniavirus extensiv verwendet worden. Um eine wirksame Impfstoffvektor mit verbesserter Selektivität für Krebszellen, Modifikationen innerhalb des viralen Genoms zu schaffen, erforderlich sind, einschließlich Gen-Deletionen oder Einführung von therapeutischen Genen.
Mit der Entwicklung der DNA-Technologie und ein besseres Verständnis der Molekularbiologie und Virologie, Insertion von Fremd-DNA in VV ursprünglich erreichend unter Verwendung der homologen Rekombination (HR) in den 1980er Jahren 15. Dieses Verfahren ist immer noch weit verbreitet VV-Vektoren für die Konstruktion. Einführung der genetischen Modifikation unter Verwendung eines Shuttle-Vektors für HR erreicht, die in pre-infizierten Zellen mit der VV-Genom rekombiniert. Jedoch hat dieses Verfahren als sehr ineffizient erwiesen (weniger als 1% homologe Rekombinationseffizienz 16) und führt oft in zufällige Insertion des Selektionsmarkers in Nicht-Zielbereiche und / oder den Verlust des Markers auf Virus Expansion.
Die Effizienz der DNA homologe Rekombination zum Einführen exogener DNA in genomische Loci kann drastisch in Gegenwart von Doppelstrangbrüchen (DSB) 17 verbessert werden. Daher ist die Technologie, die DSBs an Ziel-Loci birgt ein großes Potenzial für die Genomtechnik von VV induzieren kann.
Die neu entwickelte CRISPR-Cas9 System zeigt Versprechen für DSBs in jedem VV-Gen-Region auslösen. CRISPR-Cas9 ist ein RNA-geführte Nuklease in adaptiven Immunität gegen eindringende Phagen und andere fremde genetische Materialien beteiligt 18-20. Es gibt drei CRISPR-Cas – Systeme im Bereich der mikrobiellen Spezies 21. Der Typ II CRISPR-Cas-System ist für die Bearbeitung des Genoms von eukaryotischen Zellen und große Viren weit verbreitet. Es besteht aus dem RNA-guided Cas9 Endonuklease (aus Streptococcus pyogenes), eine einzige Führungs RNA (sgRNA) und das trans-aktivierende crRNA (tracrRNA) 22-24. Die Cas9 / sgRNA Komplex erkennt die komplementären 20-Nukleotid – genomischen Sequenz vorhergehenden einem 5'-NGG-3 'Protospacer benachbarten Motiv (PAM) Sequenz in Säugetierzellen 22, 23. Es ist für effektive Erzeugung von gentechnisch veränderten Zellen, Viren erfolgreich eingesetzt wurde und Tiermodelle 22-32.
Der CRISPR-Cas9 System hat sich als ein effizientes Werkzeug für die Genom in Kombination im Zytoplasma von VV mit homologe Rekombination gezielt zu infizierten CV-1-Zellens zu erzeugen mutierten Vaccinia – Viren 33, 34 dar . Um die mögliche Anwendung dieses Verfahrens zu verlängern, wir detaillierte Informationen über dieses Systems Methodik vorzustellen. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine Mutante VV mit einem bestimmten Gen-Deletion zu erzeugen und / oder den Arm des mutierten Virus mit einem therapeutischen Transgen.
Es gibt zwei Hauptziele in Bezug auf Änderung von VV zu therapeutischen Zwecken. Eines ist ein bestimmtes Gen, wie beispielsweise die Thymidinkinase (TK) Gen zu deletieren Virus für Anti-Tumor-therapeutische Verwendung zu dämpfen. Die andere ist, VV mit einem gewünschten therapeutischen Gens (wie etwa GM-CSF) oder ein Markergen (wie Luciferase-Gen) zu bewaffnen. eine dieser Verwirklichung beinhaltet das Löschen eines Zielbereichs / Gen. Eine direkte DNA Ligierungstechnik 35 und ein In – vitro – Verpackungsverfahren 36 verwendet wurden zuvor mutierten Vaccinia – Viren mit TK Genveränderungen zu erzeugen. Jedoch haben diese Verfahren beschränkt Anwendung Mutation von anderen Regionen im Genom hinsichtlich aufgrund eines Mangels an einzigartigen Restriktionsenzymstellen über das Genom. Der derzeitige Ansatz Mutante VV zur Schaffung beinhaltet Transfektion eines Shuttle (Donor) Vektor mit einem Selektionsmarker (RFP oder GFP) in CV-1-Zellen zwei Stunden nach der Infektion mit VV eine homologe Rekombination diedrei zu induzierenng der Selektionsmarker in den Zielbereich. Die Auswahl der Marker-positiven Plaques wird durch ihre Reinigung 24 h nach der Transfektion gefolgt. Die Plaque-Reinigungsverfahren kann bis zu 10 Runden, letzten 3-4 Wochen dauern und führt oft zu unerwünschten rekombinanten Viren mit Selektionsmarker in Off-Target-Regionen eingesetzt. DNA – Doppelstrangbrüchen effektiv homologe Rekombination in Säugerzellen 37, induzieren und durch diesen Mechanismus die Nutzbarmachung der Wirkungsgrad mutant VV des Erzeugens kann erheblich verbessert werden. Die gRNA geführte Cas9 System wurde in der Genom Bearbeitung und verbessert die Effizienz der homologen Rekombination in eukaryotischen Organismen 22, 25. Letzter Zeit in Wirtszellen , die Genome von Adenovirus und Typ I Herpes Simplex Virus bearbeitet wurden von der gRNA geführte Cas9 erfolgreich eingesetzt System 24. Es wurde kürzlich gezeigt, dass CRISPR Cas9 System ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Bearbeitung der VV-Genom ist und ein VV Vektor Konstruktion für eine exprimierendenbestimmten Gens.
Beide N1L gRNA geführte Cas9 und die traditionelle homologe Rekombination (HR) Methode führte zu erfolgreichen HR Ereignissen an der gleichen Zielstelle von N1L. Interessanterweise jedoch gRNA geführte Cas9 induzierte HR bei viel höheren Wirkungsgrad als die herkömmliche Methode HR. Somit beseitigt die Verwendung von gRNA gelenkten Cas9 die Notwendigkeit, so viele Plaques zu reinigen mutant VVs zu erhalten. In dieser Arbeit konnten wir deutlich die Effizienz und den Zeitrahmen für die Erzeugung von Mutanten – VV die gRNA geführte Cas9 System 33 verwendet wird . Zu beachten ist, ist ein kritischer Schritt, eine hohe Effizienz der homologen Rekombination zur Gewinnung von CV-1-Zellen mit den Plasmiden exprimieren Cas9 und gRNA für 24 h zu transfizieren, bevor die herkömmliche homologe Rekombination durchgeführt wird. Die 24-h-Intervall erlaubt Cas9 und gRNA auf einem vernünftigen Niveau zum Ausdruck gebracht werden. Ferner müssen die gRNA Sequenz, die ein bestimmtes Gen Targeting kann optimiert werden, wie wir, dass die verschiedenen gRNA t Sequenzen gefundenargeting N1L Gen in ihrer Effizienz 33, 34 variiert.
Die Begrenzung für die CRISPR / Cas9 in Bearbeitung VV ist die niedrige Rate von RFP-positiven Plaques in der ersten Runde der Rekombination. Um eine ausreichende Anzahl von RFP-positiven Plaques enthaltenden rekombinanten Virus zu erhalten, in der Regel mindestens zehn 6-Well-Platten benötigt, was macht Erstrunden-Screening langweilig. Daher besteht immer noch ein Bedürfnis, das Protokoll zu optimieren, um diese Einschränkung zu überwinden.
Die geringe Größe des RFP-positiven Plaques ist ein weiteres potentielles Problem, das zu einem hohen Volumen von Lysat zurückzuführen ist verwendet, um eine 6-Well-Platte zu infizieren. Um dies zu überwinden, sollte ein kleineres Volumen des Lysats verwendet werden, um eine 6-Well-Platte zu infizieren, um größere Größe RFP-positive Plaques erhalten. ein kleineres Volumen von Lysat wird auch für eine bessere Trennung von RFP-positive Plaques aus den RFP-negativen ermöglichen. Folglich werden weniger Runden Plaquereinigung erforderlich reine RFP-positive Plaques zu erhalten.
<pclass = "jove_content"> Off-Target-Effekte sind immer ein unerwünschtes Problem in der Gen-Bearbeitung. CRISPR-Cas9 hat Off-Target-Effekte gezeigt. Doch mit einer sorgfältigen Gestaltung von gRNA, Off-Target – Effekte können vermieden werden , wenn die Bearbeitung der VV 33, 34 Genome. Dies ist der besondere Vorteil der gRNA geführte Cas9 System für die Bearbeitung des Genoms von VV. In Anbetracht der Versprechen von VV, mit dem CRISPR / Cas9 System wird die Entwicklung von mutierten VVs für die biomedizinische Forschung und in der translationalen Medizin beschleunigen. Darüber hinaus würde ein solches System auch beschleunigen Entdeckungen in der Zellbiologie, wie Dissektion der Signalwege von VV verwendet für die Aktin-basierte Motilität.The authors have nothing to disclose.
This work was supported by The MRC DPFS grant (MR/M015696/1) and Ministry of Sciences and Technology of China (2013DFG32080).
Plasmid #41824 | 41824 | Addgene | gRNA cloning vector |
pST1374 | 13426 | Addgene | Cas9 cloning vector |
pGEMT easy | A1360 | promega | repair donor vector cloning |
One Shot TOP10 Chemically Competent E .Coli | C4040-10 | Invitrogen | transformation |
QIAprep Spin Miniprep Kit | 27106 | Qiagen | plasmid extraction |
Dulbecco’s Eagle’s Medium (DMEM) | 11965-092 | Life Technologies | cell culture medium |
fetal bovine serum (FBS) | SH30088.03HI | Hyclone | cell culture serum |
penicillin, streptomycin | 15070-063 | Thermo Scientific | antibiotics |
Effectene | 301425 | Qiagen | transfection |
Thermo Scientific Nalgene Cryogenic vial; 2.0 mL | W-06754-96 | Thermo Scientific | collect virus |
fluorescence microscope | Olympus BX51 Fluorescence | Olympus | find RFP-positive plque |
DNeasy Blood & Tissue Kit | 69506 | Qiagen | DNA extraction |
Extensor Long PCR ReddyMix Master Mix | AB-0794/B | Thermo Scientific | PCR reagent |
10cm culture dish | Z688819-6EA | sigma | cell culture |
6-well plate | Z707759 | sigma | cell culture |
cell scraper | C5981 | sigma | scrap cells |
1XTrypsin-EDTA solution | T4299 | sigma | trypsinize cells |
Virkon | 95015661 | Anachem Ltd | desinfectant |
Falcon tube | CLS430791-500EA | Sigma | hold cell suspension |
N1L forward 5’-TATCTAGCAATGGACCGT-3’ | Sigma | PCR primer | |
N1L reverse 5’-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3' | Sigma | PCR primer | |
A52R forward 5’-ATAGGATTGTGTGCATGC-3’ | Sigma | PCR primer | |
A52R reverse 5’-TTGCGGTATATGTATGAGGTG-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP forward 5’- GCTACCGGACTCAGATCCA-3’ | Sigma | PCR primer | |
RFP reverse 5’-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3’ | Sigma | PCR primer | |
Argarose | A7431 | Sigma | resolve PCR product |
G:BOX F3 | G:BOX F3 | Syngene | UV gel doc |