Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.
The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the γ-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the γ-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.
Over the last years, temperature sensitivity has no longer been described as a somesthetic sense only, but also as a physiological function relevant for the olfactory system. In rodents, the main olfactory bulb receives input from the Grueneberg ganglion (GG), an organ in the nasal cavity, consisting of thermosensitive neurons. GG neurons respond to cool temperatures1 as well as to chemical stimuli, and their chemosensitivity is modulated by temperature fluctuations2. These observations suggest that the olfactory bulb may integrate chemical and temperature information collected at the nose. In order to explore this hypothesis, we present here a set of experiments enabling the detection of temperature responses in the olfactory bulb of non-transgenic animals, using the Xenopus laevis larva as a model. The organization of the olfactory system in these animals closely resembles that of mammals. The olfactory receptor neurons of premetamorphic X. laevis terminate in tufts, and make synaptic contacts with the dendrites of second-order neurons, the mitral cells. Pre- and postsynaptic fibers intermingle and form skein-like neuropil structures called glomeruli3. The abundant synapses of the glomerular layer represent the first processing center of olfactory information. Mitral cells further integrate the sensory input and convey it to higher olfactory areas.
We have developed a protocol combining electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) with calcium-sensitive and non-sensitive dyes followed by bolus loading of the postsynaptic network of glomeruli and mitral cells. The staining by electroporation of two spectrally distinct dyes loaded in the nasal cavities serves to single out the γ-glomerulus3 through its bilateral innervation by ORNs from both olfactory epithelia. Thus, the location of the γ-glomerulus is identified prior to further measurements. Subsequently, bolus loading4 with Fluo-8 acetoxymethyl (Fluo-8 AM) is carried out in a volume comprising the γ-glomerulus. Imaging calcium changes with fast confocal microscopy allows the visualization of temperature responses in the 3D neuropil surrounding the γ-glomerulus, a unique temperature-sensitive glomerulus in this system5. Mitral cells innervating this specific structure can also be identified by their Ca2+ signals responsive to induced temperature drops. Next, activity correlation imaging6 uses the specific Ca2+ traces of these cells to reveal the dendritic morphology of thermosensitive mitral cells. Alternating repeated applications of cold Ringer solution and chemical odorants in one measurement can be used to visualize the mitral cell networks for odor and temperature processing surrounding the γ-glomerulus and identify potential overlaps. To unambiguously assign the responses to either the chemical or the temperature stimulus, we constantly monitor temperature at the olfactory epithelium.
Os métodos aqui apresentados visam processamento de registro da temperatura no bulbo olfativo de Xenopus laevis girinos. As manchas de protocolo primeiras e segundas neurônios ordem no bulbo olfativo e proporciona uma preparação de amostras em que o sistema olfativo permanece essencialmente intacto. Assim, a activação do glomérulo-γ sensível à temperatura pode ser monitorizada e comparada com os seus vizinhos glomérulos sensível à quimioterapia. A inervação bilateral única deste glomérulo é visualizado por eletroporação celular com espectralmente diferentes corantes. Além disso, permite o carregamento de bolus para a coloração das células mitrais que abrangem uma grande volume no interior do bolbo olfactivo. Os sinais induzida pela temperatura de processamento de rede neuronal é revelado, tomando as medidas de cálcio com aplicações de estímulo repetidas e, posteriormente, analisar os dados com imagens de correlação atividade.
O protocolo destaca dois sofisticada proce coloração mentos, ambos os quais requerem a manipulação e a prática cautelosa, de modo a conseguir resultados satisfatórios e reprodutíveis. Durante a eletroporação qualquer ferimento dos animais tem de ser evitada, especialmente quando o posicionamento dos eletrodos nas narinas. Idealmente, nenhum contato com o epitélio olfativo deve ocorrer. Note-se que os animais ainda estão vivos após o procedimento de electroporação e o seu tempo de recuperação deve ser tida em conta. Se a coloração permanece muito fraco após um ciclo de electroporação, o que pode acontecer, dependendo dos tipos de corantes utilizados, a sua intensidade pode ser aumentada através do aumento da concentração do corante nas narinas. Uma vez que as moléculas acoplado-dextrano são transportadas através de vários mecanismos incluindo transporte axonal lenta (a uma velocidade de 1-2 mm / dia 10) e difusão passiva, uma outra alternativa é de esperar 48 horas após a electroporação antes de sacrificar os animais. Alternativamente, a electroporação pode ser repetido ao fim de um dia de recuperação.
jove_content "> Bolus de carregamento é um passo crítico desde que a quantidade de corante entrar nas células mitral é difícil de regular e depende de vários parâmetros como o tamanho da ponteira e a localização da aplicação. Acompanhamento do processo sob um microscópio de fluorescência confocal prova ser útil para ajustar a duração de aplicação de corante e, assim, a geração de resultados de coloração semelhantes em preparações. para além disso, os girinos anteriormente electroporadas deve ser utilizado para determinar a melhor posição para a aplicação do corante através da identificação da posição do pequeno aglomerado (que compreende o γ-glomérulo). o mais passo crítico durante as medições consiste em evitar tanto deslocamento e de branqueamento da amostra. o deslocamento pode ser evitada posicionando cuidadosamente o fluxo de Ringer sob o microscópio. Tal como para limitar o branqueamento da área de interesse, o tempo de medição deve ser reduzida ao essencial .Bolus de carga coloração com corantes sensíveis ao cálcio fornece apenas muitocontraste limitado, já que as células saudáveis geralmente têm baixos níveis de cálcio e, assim, mostrar fraca fluorescência basal. Aplicando imagem correlação atividade contorna essa limitação através da geração de contraste com base em estruturas de actividade e realces com sinais de cálcio semelhantes. Este método de análise pós-aquisição calcula o factor de correlação entre o sinal de cálcio de uma região de interesse seleccionada (traço de referência) e de que de cada pixel individual do volume 3D. Portanto, os resultados obtidos dependem fortemente o padrão de actividade seleccionada como traço de referência. Se o foco principal é a visualizar os padrões de inervação células mitrais, um sinal de referência derivado de uma actividade neuronal espontânea é o preferido, e a escolha das células mitrais mais activos produzirá os melhores resultados. Para revelar as redes quimio ou termossensíveis de células mitral, os traços de referência contendo apenas respostas a qualquer histidina ou Ringer frio deve ser selecionada. A selecção da totalidade de um glomérulo ór soma célula mitral como a região de interesse nem sempre pode fornecer um traço de referência clara, especialmente se as estruturas que respondem aos dois estímulos diferentes são deitado em cima uns dos outros. Em tal caso, é muitas vezes útil para seleccionar uma área menor do glomérulo ou corpo celular como a região de interesse.
Nas últimas décadas, electroporação tem sido descrito como um método eficiente para corar células únicas ou múltiplas 11,12. Aqui ele é usado para rotular especificamente neurônios receptores olfativos. Moléculas de dextrano conjugado dar a maior eficiência, e para corantes não sensíveis ao cálcio, o intervalo de selecção é amplo e cobre o espectro completo tipicamente usado em microscopia de fluorescência 13. No entanto, corantes sensíveis ao cálcio que são electroporadas com sucesso em neurônios receptores olfativos estão no momento limitado a dextrano de cálcio-verde, e Fluo-4 dextrano se ainda disponível no mercado. Além disso, as gravações alvo principalmente superficial camadas na superfície ventral de apenas o bulbo olfativo, uma vez que a profundidade de penetração de técnicas de medição rápida é limitado. imagens de dois fótons podem, em parte, superar essa limitação, mas muitas vezes não tem velocidade e restringe a quantidade de corantes sensíveis ao cálcio selecionáveis ainda mais.
Descrevemos aqui um protocolo para medir a actividade induzida pela temperatura no bolbo olfactivo. O neurópilo cérebro é explorado como um volume tridimensional para visualizar as redes celulares complexas envolvidas no processamento olfativo da temperatura. Medindo a actividade induzida pela temperatura no bolbo olfactivo foi muito recentemente relatado 5 e requer um processo especialmente personalizado combinação de técnicas diferentes. Um trunfo importante das técnicas apresentadas acima é que centenas de células são fotografadas em três dimensões em uma preparação em que a maior parte do sistema olfactivo permanece intacta. Estas vantagens colocar elevadas exigências sobre as técnicas de coloração, bem como o cérebro preparação e de imagem. Por exemplo, a electroporação de células e de ataque em bolus atingido grandes quantidades de células no epitélio olfactivo e do bulbo, e, assim, permitir a visualização de redes celulares completos. Além disso, a entrega de indicadores químicos por meio de ataque em bolus em vez de fluoróforos geneticamente codificados permite medições em um conjunto de espécies potencialmente maior. Outras alternativas, como a incubação de banho com corantes AM trabalhar principalmente em fatias que danificam o bulbo olfativo severamente, deixando apenas algumas centenas de micrômetros de tecido intacto. Em comparação, toda a preparação montagem utilizado em nosso protocolo garante, por exemplo, que a inervação bilateral da γ-glomérulo permanece intacto e as gravações são, assim, tomado em um sistema ainda operatório. Finalmente, a própria imagem é feito por microscopia de linha-de iluminação que permite a aquisição de volumes 3D. Microscopia Line-iluminação é uma das técnicas confocal proporcionando as mais altas taxas de aquisição possíveis 6 </ Sup>, que são necessários para cobrir uma grande fração do bulbo olfativo. sistemas de aquisição mais lentos podem ser utilizados, mas tem a desvantagem de que o tamanho do volume gravado deve ser reduzida. Nos últimos anos, outros métodos para a aquisição de imagem rápida têm sido desenvolvidos e podem ser utilizados como alternativas 14,15. No entanto, microscopia line-iluminação continua sendo um dos métodos mais fáceis para ganhar velocidade e resolução suficiente. Aqui seguem algumas informações como diretrizes para selecionar configurações de imagem adequados. Desde imagem de cálcio é feito dentro das preparações cerebrais grossas, a instalação deve fornecer confocalidade decente e os objetivos devem ter aberturas numéricas de 1,0 ou superior. Para um ponto de referência, as gravações feitas com o microscópio linha de iluminação correspondem a imagens tiradas com um microscópio de varredura a laser padrão com um tamanho de pinhole de 0,5-1 unidades arejados. A velocidade rápida aquisição é desejável. Um volume com uma espessura de 20 um coberto por, pelo menos, 5 lAyers, um campo lateral de visão de 100 mm x 100 mm e um tamanho de pixel de 0,5 mm ou menores devem ser verificados a uma velocidade mínima de 1 Hz por pilha. A redução do confocalidade pode aumentar a quantidade de fotões contados e, assim, permite a aquisição mais rápidos se for necessário, mas tem o inconveniente de gravação de mais luz para fora de foco. No entanto, uma vez que uma tal abordagem aumenta a espessura das fatias ópticos, que podem, na verdade, facilitar o rastreio dos dendritos através de diferentes z-planos após a aplicação de ACI 6.
As ferramentas necessárias para estudar extensivamente processamento de temperatura em redes bulbo olfativo são aqui apresentados. atividade induzida pela temperatura devem ser registados nos primeiros e segundo neurônios de ordem via corantes e ambos os sinais que chegam e partem do γ-glomérulo sensível ao cálcio. Além disso, na medida em que as células individuais mitral processar tanto informações químicas e de temperatura podem ser avaliadas. Desde o lea preparaçãova-se o bolbo olfactivo intacta, o papel da inervação bilateral no processamento olfactivo podem ser mais bem estudadas. O processo também é útil para revelar se e como termo-chemoinformation e é codificado em sobreposição redes olfactivos 5. Finalmente, as técnicas acima mencionadas não estão limitados ao estudo das respostas de temperatura no bolbo olfactivo, mas pode ser aplicado para uma avaliação mais geral do sistema olfactivo, em especial as redes celulares de processamento de grandes volumes de três dimensões. Ataque em bolus e imagem correlação atividade são ferramentas poderosas para observar e comparar a atividade de dezenas de neurônios, tornando-as aplicáveis a diferentes redes cerebrais 16.
The authors have nothing to disclose.
This project was funded by the DFG Excellence Cluster 171, the Center for Nanoscale Microscopy and Molecular Physiology of the Brain, the Bernstein Center for Computational Neuroscience and the ENC-Network, an Erasmus Mundus Joint Doctoral Program. The authors thank Stephan Junek, Mihai Alevra and Guobin Bao for providing MATLAB codes and custom-written programs for image evaluation and data analysis.
Reagents | |||
Sodium chloride | Merck Millipore | 1064040500 | |
Potassium chloride | Merck Millipore | 1049360250 | |
Calcium chloride dihydrate | Merck Millipore | 1023820250 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Merck Millipore | 1058330250 | |
D(+)-Glucose | Merck Millipore | 1083371000 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
HEPES | Merck Millipore | 1101100250 | |
Calcium Green 10 kDa Dextran | Thermo Fisher Scientific | C-3713 | |
Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | D-22914 | |
Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | D-22911 | |
Fluo-8 AM | TEFlabs | 203 | |
MK571 | Alexis Biochemicals | 340-021-M005 | |
MS-222 | Sigma-Aldrich | E10521 | |
Pluronic acid F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | powder |
L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 53370 | |
DMSO | Merck Millipore | 1029522500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Electronic pipette | BrandTech | HandyStep Electronic Repeating Pipette | |
NiCr-Ni thermocouple | Greisinger Elektronik | GTF 300 | |
Micropipette puller | Narishige | Model PC-10 | two-step puller |
Funnel applicator | (Custom-made) | ||
Line-illumination microscope | (Custom-made) | otherwise, a commercially available spinning disk microscope | |
Objective W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Zeiss | 441470-9900-000 | |
Objective W Plan-Apochromat 40x/1.0 DIC | Zeiss | 441452-9900-000 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
MATLAB | The MathWorks | from R2010b upwards |