<em> Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve> Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım
Summary
Burada, hasat korumak ve patojen ilişkili moleküler modelleri (PAMPS) ve Listeria monocytogenes fare ince bağırsak organoids tedavisi için bir protokol da gen ifadesi ve protein için uygun normalizasyon ağırlıklı olarak, tarif edilmektedir.
Abstract
Primer bağırsak organoids önemli ölçüde mukozal immünoloji alanında etkileme potansiyeline sahip değerli bir model sistem. Ancak, organoid büyüme özelliklerinin karmaşıklığı araştırmacı için önemli uyarılar taşır. Spesifik olarak, her bir organoid büyüme desenler oldukça değişkendir ve kültür epitel hücrelerinin bir heterojen oluşturun. Bu uyarılar, ortak bir doku kültür uygulamaları sadece bağlı hücresel yapının karmaşıklığına organoid sistemine uygulanamaz. Bazı normalizasyon tekniği uygulandığı sürece Sayma ve hücre hatları gibi ayrı ayrı ayrılmış hücreler için ortak olan hücre sayısı, yalnızca dayalı kaplama, organoids için güvenilir bir yöntem değildir. toplam protein içeriğine Normalize bağlı yerleşik protein matrisi karmaşık yapılır. salgılanmış con değerlendirirken hücre sayısı, şekli ve hücre türü açısından Bu özellikler dikkate alınmalıdırorganoid kitleden çadırları. Bu protokol kültürüne basit bir prosedür anahat ve mikrobiyal patojenler ve patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ile ince bağırsak organoids tedavi oluşturuldu. Aynı zamanda protein analizi, böyle bir mücadeleden sonra yapılır iken uygulanmalıdır normalleştirme teknikleri vurgulamaktadır.
Introduction
Becerisi hasat ve kültürü birincil organoids doku biyolojisinde 1-5 için daha fazla fizyolojik olarak Örnek olguları anlama germane verici gelişmeleri ince bağırsak, kolon, pankreas, karaciğer ve beyin için tarif edilmiştir ve. Ince bağırsak organoids kültürünü ve bakım açıklayan ilk yöntemler Sato ve arkadaşları tarafından rapor edildi. Hans Clevers 1 laboratuar dışında. Bu yöntem, hasattan ve ispat primer intestinal epitelyal hücrelerin kültürü önce sınırlı ve epitel hücre büyümesinin sürdürülmesi etkisiz olduğunu göstermiştir. Yöntem sonuçta karışmış primer fibroblast hücreleri 6 büyümesinin yol açacak gibi kollajenaz ve dispase gibi enzimler ile inkübasyon yoluyla doku ayrılmasını içermektedir. Bu koşullar aynı zamanda zaman epitel hücre kültürü sürdürülmesinde sınırlı olacaktır. epitel hücreleri nedeniyle apoptoz girecek hiçbir epitel hücre niş Minimal, kuracaktıUygun büyüme faktörleri ya da kontak bütünlüğü kaybı olmaması anokis 7 olarak adlandırılan. 3D-organoid kültür sisteminin çıkışı sürekli kültürü 1 intestinal hücre tiplerinin spektrumu içeren kültür primer bağırsak hücreleri için bir yöntem sağlamıştır. Bu epitel organoids da birkaç farklı hücrelerden oluşan, öyle ki hücre çizgileri üzerinde avantajlara sahip ve daha iyi bunlar, in vivo 8 elde edilir organı taklit eder. süreç sonunda farklı uyaranlara altında bağırsak epiteli yanıtını değerlendirmek için değerli bir araç olduğunu kanıtlamıştır "bir tabak içinde mini gut büyümek". Bu moleküler desenleri host ve mikrop 9 hem farklı yanıtları düzenleyen gibi mikrobik patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMPS) ile primer intestinal hücrelerinin etkileşimi araştıran immünoloji alanında alakalı. Sadece Araştırmacılar şimdi fare organoids bu etkileşimleri keşfetmek, ama onlar yapabilirsinizkuyu 2 olarak insanlardan kültüre olabilir. Bu teknoloji dramatik kişiselleştirilmiş tıp değiştirme potansiyeline sahiptir ve tekniğin yakın gelecekte mümkün hale getirecek ilerlemeler hakkında kurgulanabilir.
Bu yöntem genel amacı, çeşitli uyaranlara bir kültür, genişleme için protokol ve barsak organoids bir tedavinin temin edilmesini sağlamaktır. Bu tür uyaranlar aşılar, bakteriyel PAMPS, canlı patojenler, gastrointestinal (Gİ) ve kanser tedavi dan sonuçta uzanabilir. Fare bağırsak organoids izolasyonu ve kültürü Sato ve ark adapte edilmiştir. Bu protokolü takip ederken, son ürün kültürü organoid olmak hala elde edilir orijinal yönteminden hafif sapmalar olmasına rağmen. Bu yöntem, hücre n dayalı bir tahlilin gerçekleştirilmesi dikkate alınmalıdır homojen olmayan hücre yapıları, çalışırken uygun normalizasyonu için yeterli bir teknik tarif odaklanmıştırkoyu kahverengi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bağırsak organoids kültürü ve bakım yeterli doku kültürü tekniği ile herhangi bir birey tarafından hakim olabilir bir işlemdir. Orada bir daha geleneksel tek tabaka hücreleri büyüyen karşılaştırıldığında Pasajlanması içinde inceliklerini, ancak bu inceliklerini üstesinden gelmek için zor değildir. Bu yöntemin kritik adımlar optimum tohumlama için yeterince yüksek bir yoğunluğa organoids büyümek için güçlü olmak içerir. genel olarak hücre hatları ile elde edilebilir, büyük ekm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Dr. Sheryl Coutermarsh-Ott, Dylan McDaniel and Bettina Heid for technical discussions. The authors thank Dr. Nanda Nanthakumar for providing the Caco-2 cells. The authors also thank The Multicultural Academic Opportunities Program (MAOP) at Virginia Tech. This work was supported by the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases Award K01DK092355 (to I.C.A.). The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11050 | (Section 1,3,6) Or equivalent brand |
| Sorvall Legend XTR Centrifuge | Thermo | (Section 1,3) | |
| DMEM | GE Healthcare | Sh30243.01 | (Section 1,6) For Caco-2 and HEK293 Rspondin1 cells |
| HEK293T-Rspondin1 secreting cell line | (Section 1) Described and modified from Kim, K.A. et al. Lentiviral particles contained RSPO1(NM_138683) ORF cDNA cloned into a pReceiver-Lv105 backbone custom ordered and purchased from GeneCopoeia. | ||
| 50 ml conical tube | Falcon | 352070 | (Section 1) Or equivalent brand |
| T-175 Flask | Corning | 431079 | (Section 1) Or equivalent brand |
| Protein Matrix | Corning | 356231 | (Section 2,3,4,5,6) Matrigel Growth Factor Reduced |
| HyClone Dulbecco's (DPBS) | GE Healthcare | SH30264.01 | (Section 2,3) |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 12634-010 | (Section 2,3) Advanced DMEM/F12 |
| Corning 24 Well TC Plates | Corning | 3524 | (Section 2) |
| N2 Supplement 100x | Life Technologies | 17502-048 | (Section 2) |
| B27 without vitamin A 50x | Life Technologies | 12587-010 | (Section 2) |
| Trizol | Life Technologies | 15596-026 | (Section 2) |
| Glutamine Supplement (Glutamax) | Life Technologies | 35050-061 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| HEPES (1 M) | Life Technologies | 15630-080 | (Section 2) Can Combine with Advanced DMEM/ F12 |
| 10ml Serological Pipet | Falcon | 357551 | (Section 2) Or equivalent brand |
| Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | (Section 2) Stock = 100 mg/ml |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | (Section 2) Stock = 1M |
| Recombinant Mouse EGF | Biolegend | 585608 | (Section 2) Stock = 500 mg/ml |
| Rocker Variable | Bioexpres | (Section 3) | |
| dissecting scissors | (Section 3) | ||
| forceps | (Section 3) | ||
| glass slides | (Section 3) | ||
| dissecting tweezers | (Section 3) | ||
| 25 ml Serological Pipet | Falcon | (Section 3) | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | SLBB9821 | (Section 3) 0.5M or alternative TC grade EDTA |
| Sterile Petri Dish 100mm x 15mm | Fisher | FB0875712 | (Section 3) Or equal sized TC dish |
| 1ml Syringe | Becton Dickinson | 309659 | (Section 4) |
| Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305120 | (Section 4) 23G x 1 1/4 (0.6mm x 30mm) |
| Flagellin from Bacillus subtilis | Invivogen | tlrl-bsfla | (Section 5,6) |
| Listeria monocytogenes | ATCC | 19115 | (Section 5,6) (Murray et al.) |
| Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | (Section 5,6)Or equivalent brand |
| BBL Brain Heart Infusion Agar | Becton Dickinson | 211065 | (Section 5) |
| Bacto Brain Heart Infusion | Becton Dickinson | 237500 | (Section 5) |
| Caco-2 | ATCC | HTB-37 | (Section 6) |
| Trypsin | gibco | 25200056 | (section 6) |
| Methanol | Fisher | A412-4 | (Section 6) |
| SpectraMax M5 | Molecuar Devices | (Section 6) | |
| 96 Well Assay Plate | Corning | 3603 | (Section 6) Black Plate, Clear Bottom TC treated |
| Nuclear Staining Dye | Life Technologies | H1399 | (section 6) Hoechst 33342 |
| T-75 Flask | Corning | 430641 | (Section 6) Or equivalent brand |
| 15 ml conical tube | Falcon | 352096 | (Section1,3) Or equivalent brand |
| 1.7 ml polypropylene tube | Bioexpress | C-3262-1 | Or equivalent brand |
| Quick-RNA MiniPrep | Zymo Research | R1054 | Or equivalent brand |
| TNF-alpha | Applied Biosystems | Mm 00443260_g1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-6 | Applied Biosystems | (Mm 00446190_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-1beta | Applied Biosystems | Mm 00434228_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| IL-18 | Applied Biosystems | Mm 00434225_m1 | Taqman gene expression assay kit |
| 18s | Applied Biosystems | Hs 99999901_s1 | Taqman gene expression assay kit |
| 7500 Fast Real Time PCR System | Applied Biosystems | ||
| Nexus gradient Mastercycler | Eppendorf | ||
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4352042 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies/Applied Biosystems | 4368814 | |
| Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL | Life Technologies/Applied Biosystems | 4346907 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 Protein | R&D Systems | 3474-RS-050 | 500 ng/ml |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C7559 |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
- Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Freshney, R. I., Freshney, M. G. . Culture of epithelial cells. 2nd edn. , (2002).
- Vachon, P. H., et al. Differentiation state-selective roles of p38 isoforms in human intestinal epithelial cell anoikis. Gastroenterology. 123 (6), 1980-1991 (2002).
- Hynds, R. E., Giangreco, A. Concise review: the relevance of human stem cell-derived organoid models for epithelial translational medicine. Stem Cells. 31 (3), 417-422 (2013).
- Kaiko, G. E., Stappenbeck, T. S. Host-microbe interactions shaping the gastrointestinal environment. Trends Immunol. 35 (11), 538-548 (2014).
- Kim, K. A., et al. Mitogenic influence of human R-spondin1 on the intestinal epithelium. Science. 309 (5738), 1256-1259 (2005).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat Protoc. 1 (2), 581-585 (2006).
- Allen, I. C., et al. NLRX1 protein attenuates inflammatory responses to infection by interfering with the RIG-I-MAVS and TRAF6-NF-kappaB signaling pathways. Immunity. 34 (6), 854-865 (2011).
- Zhang, Y. G., Wu, S., Xia, Y., Sun, J. Salmonella-infected crypt-derived intestinal organoid culture system for host-bacterial interactions. Physiol Rep. 2 (9), (2014).
- Grabinger, T., et al. Ex vivo culture of intestinal crypt organoids as a model system for assessing cell death induction in intestinal epithelial cells and enteropathy. Cell Death Dis. 5, 1228 (2014).
- Slater, T. F., Sawyer, B., Straeuli, U. Studies on Succinate-Tetrazolium Reductase Systems. Iii. Points of Coupling of Four Different Tetrazolium Salts. Biochim Biophys Acta. 77, 383-393 (1963).
- Parry, M. F., Neu, H. C. Effect of N-acetylcysteine on antibiotic activity and bacterial growth in vitro. J Clin Microbiol. 5 (1), 58-61 (1977).
