Recordings cellules entières Patch-clamp en tranches cérébrales

Summary

Ce protocole décrit les étapes de procédure de base pour effectuer des cellules entières enregistrements de patch-clamp. Cette technique permet l'étude du comportement électrique des neurones, et lorsqu'elle est effectuée dans des tranches de cerveau, permet d'évaluer les différentes fonctions de neurones à partir de neurones qui sont encore intégrés dans des circuits du cerveau relativement bien conservées.

Abstract

Whole-cell enregistrement patch-clamp est une technique électrophysiologique qui permet l'étude des propriétés électriques d'une partie substantielle du neurone. Dans cette configuration, la micropipette est en contact étroit avec la membrane cellulaire, ce qui empêche les fuites de courant et fournit ainsi des mesures de courant ionique plus précis que la méthode d'enregistrement de l'électrode utilisée précédemment intracellulaire forte. Classiquement, l'enregistrement de cellules entières peut être effectuée sur des neurones dans divers types de préparations, y compris les modèles de culture cellulaire, les neurones, les neurones dissociés dans des tranches de cerveau, et chez des animaux anesthésiés éveillés ou intacts. En résumé, cette technique a grandement contribué à la compréhension des propriétés biophysiques passives et actives de cellules excitables. Un avantage majeur de cette technique est qu'elle fournit des informations sur la façon spécifique manipulations (par exemple, pharmacologique, expérimentateur induite par la plasticité) peuvent altérer les fonctions ou c neuronales spécifiqueshannels en temps réel. En outre, l' ouverture importante de la membrane plasmique permet à la solution de pipette interne de se diffuser librement dans le cytoplasme, en fournissant des moyens pour médicaments en introduisant, par exemple, des agonistes ou des antagonistes des protéines intracellulaires spécifiques, et la manipulation de ces cibles , sans altérer leurs fonctions dans les cellules voisines. Cet article se concentrera sur l' enregistrement de cellules entières effectuées sur les neurones dans des tranches de cerveau, une préparation qui présente l'avantage d'enregistrer les neurones dans les circuits du cerveau relativement bien conservés, à savoir, dans un contexte physiologique pertinent. En particulier, lorsqu'il est combiné avec la pharmacologie appropriée, cette technique est un outil puissant permettant d'identifier neuroadaptations spécifiques qui se sont produits après tout type d'expériences, telles que l'apprentissage, l'exposition aux drogues d'abus, et le stress. En résumé, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp en tranches de cerveau fournissent des moyens pour mesurer des changements durables ex vivo préparationdans les fonctions neuronales qui ont développé chez les animaux éveillés intacts.

Introduction

La technique de patch-clamp, une technique électrophysiologique qui a été développé à la fin des années 1970 ^1,2, est un outil essentiel pour l' étude des fonctions simples ou multiples canaux ioniques dans les tissus vivants. Parmi les différentes configurations de raccordement qui peuvent être atteints, les enregistrements de cellules entières de patch-clamp permettent l'étude du comportement électrique d'une partie substantielle du neurone. Classiquement, cette technique est réalisée in vitro , soit sur ​​des coupes de cerveau, les neurones fraîchement dissociées, ou sur des modèles de culture cellulaire ^3. Quand elle est réalisée sur des neurones dans des tranches de cerveau, cette technique présente plusieurs avantages. En particulier: (i) neurones sont enregistrés dans les circuits du cerveau relativement conservées que dans une certaine mesure, et comparées à des préparations de culture cellulaire, fournissent un environnement qui est physiologiquement pertinente ^3. Ceci permet la capture précoce, ou même le suivi en temps réel, les événements cellulaires et moléculaires qui sont déclenchées par tout type de pharmacolog aiguëmanipulations iques – une résolution temporelle qui ne peut être réalisé en utilisant classique dans des conditions in vivo; (ii) la capacité d'identifier visuellement les régions du cerveau dans des tranches de cerveau permet une haute spécificité régionale ³ fois pour la région du cerveau étudié et pour les neurones spécifiques quand ils expriment des marqueurs fluorescents; (iii) l' accès à l'espace intracellulaire de la cellule par l' ouverture d' une partie importante de la membrane du plasma (contrairement à la perforation de la membrane avec une micropipette forte pour les enregistrements intracellulaires) ^4. À son tour, cela permet à la teneur ou la concentration en ions spécifiques qui composent la solution interne à modifier les cibles moléculaires ou si les mécanismes cellulaires peuvent être étudiés dans des conditions différentes. Par exemple, lors de l' établissement configuration cellule entière, tout agent pharmacologique spécifique (par exemple, des antagonistes) que l' on peut ajouter à la micropipette d'enregistrement (patch pipette) solution directement diffuse dans le cytoplasme et agir en son putative cibles intracellulaires, sans altérer la fonction cible dans les cellules voisines. En outre, par rapport à l' enregistrement de micropipette forte, la grande ouverture à la pointe de l'électrode de patch-clamp offre une résistance plus faible, moins de bruit en concurrence, et donc un meilleur accès électrique à l'intérieur de la cellule ^4. Toutefois, notez que la grande ouverture à la pointe de la pipette peut conduire à une dialyse cellulaire, et donc la perte de machinerie moléculaire intracellulaire qui peut être critique pour l'expression des phénomènes biologiques qui sont à l'étude ^5,6. Dans ce cas, les enregistrements d'électrodes pointus peuvent être plus appropriés. Ce type d'enregistrement nécessite des micropipettes avec des pores qui est beaucoup plus petite que celles utilisées pour l'enregistrement de cellules entières, empêchant ainsi la majeure partie de l'échange d'ions entre l'espace intracellulaire et la solution de pipette interne.

Toute forme d'expérience (aiguë ou chronique), y compris l' apprentissage ^7-10, l' exposition aux drogues ^11,12, le stress ^13,14, etc., peuvent modifier divers aspects de la fonction neuronale dans des régions spécifiques du cerveau. Parce que ces modifications nécessitent souvent le temps de développer (heures à quelques jours), des enregistrements de cellules entières dans des tranches de cerveau provenant d'animaux qui ont subi une expérience spécifique permettent aux chercheurs d'identifier ces changements. Fondamentalement, beaucoup (sinon la totalité) des composants qui participent à des fonctions neuronales (par exemple, les canaux ioniques activés par des ligands, des canaux ioniques voltage-dépendants, les transporteurs de neurotransmetteurs), et ainsi l' activité des circuits cérébraux et de comportement, peuvent être modifiés par l' expérience (dépendant de l' expérience plasticité) ^10,15-17. Au niveau neuronal, l' activité des circuits cérébraux émerge des interactions constantes entre synaptique (par exemple, la transmission du glutamate) et les facteurs intrinsèques de l' excitabilité cellulaire (par exemple, les canaux ioniques axosomato-dendritique: sodium, Na ^+, potassium, K ^+, et de calcium, Ca ²⁺ ). Dans des conditions spécifiques en utilisant whole-cell patch-clamp techniques électrophysiologiques, des altérations de signaux provenant spécifiquement des changements de rapport synaptique excitabilité intrinsèque peut être isolé.

Dans la plupart des cas, l' excitabilité synaptique est évaluée en utilisant la technique de voltage-clamp à cellules entières. Ce mode d'enregistrement permet la mesure des courants ioniques [par exemple, médiée par des récepteurs d'acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique ( récepteurs AMPA) et des récepteurs N-méthyl-D-aspartique (récepteurs NMDA)] à travers la membrane plasmique des neurones tout en maintenant le potentiel de membrane à une tension de consigne. Ici, les expérimentateurs utilisent les solutions internes de micropipette qui contiennent du césium (Cs ^+), un large bloqueur des canaux K ⁺ (facteurs clés de l' excitabilité intrinsèques). Lors de l' établissement de la configuration de cellule entière, la diffusion de Cs ⁺ dans l' espace intracellulaire , bloque les canaux K ^+, et ainsi permettra à la fois un espace de serrage et de pré relativement efficacevent influence des facteurs d'excitabilité intrinsèques sur d'autres mesures. Questions Espace-clamp, à savoir la difficulté de voltage-clamp toute la cellule, se posent lors de l' enregistrement des cellules de forme irrégulière (par exemple, les neurones), et en particulier les neurones avec un dendritique vaste et complexe tonnelle ^18,19. Parce que somatique de verrouillage de tension de contrôle mal la tension dans l'arbre dendritique des neurones, les divers aspects de signaux électriques dendritiques à l'étude sont déformées d'une manière dépendant de la distance dendritique. Combinés avec des outils pharmacologiques telles que la picrotoxine (acide gamma-aminobutyrique, le GABA _Un antagoniste des récepteurs) ou de l' acide kynurénique (large bloqueur des récepteurs du glutamate) dissous dans la solution extracellulaire (liquide céphalo-rachidien artificiel, ACSF), cette technique permet la mesure du glutamate et _un récepteur – GABA R-médiée courants , respectivement.

En revanche, l'excitabilité intrinsèque est généralement évaluée en mode d'enregistrement en cours-clamp.Par opposition à l'enregistrement voltage-clamp, ce mode d'enregistrement permet de mesurer les variations de potentiel de membrane induite par des courants d'ions circulant à travers la membrane plasmique des neurones. En règle générale, la modification de l'excitabilité intrinsèque est évaluée par des changements dans la capacité des neurones à générer des potentiels d'action, ce qui nécessite à la fois Na ⁺ et K canaux ^+. Par conséquent, lors de l' exécution des enregistrements de courant de serrage, les micropipettes sont remplies avec une solution interne qui contient K ⁺ au lieu de Cs ^+. Combinés avec des agents pharmacologiques qui bloquent le glutamate et le GABA _A courants médiés par les récepteurs dissous dans le ACSF, ce modèle expérimental permet la mesure de la contribution des facteurs intrinsèques (par exemple, des canaux K ⁺⁾ à la décharge neuronale sans être contaminé par des changements potentiels de l' excitabilité synaptique facteurs.

Cet article décrit les étapes de la procédure de base nécessaires to (i) préparer des tranches de cerveau en bonne santé; (Ii) réaliser la configuration de cellule entière, et (iii) de surveiller les paramètres de base pour évaluer synaptique et excitabilité intrinsèque.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux UT Southwestern, et ont été choisis de manière à minimiser le stress, l'inconfort et la douleur ressentie par les animaux de laboratoire. 1. Solutions Note: Préparer des solutions internes de micropipette à l'avance. Pour la plupart des fins expérimentales de base, deux types de solutions devraient suffire: des solutions à base de…

Representative Results

La température, un facteur qui est facilement contrôlée par l'expérimentateur, influe sur les propriétés biophysiques des canaux ioniques et des récepteurs, et ainsi la forme d' onde des courants postsynaptiques (PSC) (RPEC et CISP) et la capacité des neurones à susciter des pics. Figure 3 et la figure 4 montrent l'effet de la température sur la décharge neuronale et la pente de EPSCs évoqués (les eEPSCs) , respectivement. Le mot…

Discussion

Ce protocole décrit la procédure de base pour effectuer des cellules entières expériences de patch-clamp sur les neurones dans des tranches de cerveau. Cependant, la complexité, le potentiel et la sensibilité de cette technique ne peuvent pas être décrits en détail dans cet article. Ici, nous avons essayé de définir les étapes les plus élémentaires et de souligner les paramètres importants qui doivent être contrôlés pour réaliser des enregistrements de cellules entières avec succès et rigoureux. Pou…

Materials

Isolated pulse stimulus generator	A.M.P.I	Master-8
Isolation unit (ISO-Flex)	A.M.P.I	ISO-Flex
Computer controlled Amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Digital Acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1500
Microscope	Olympus	BX-51
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200
Chamber and in-line Heater	Warner Instruments	TC-344B
Vibratome Slicer	Leica	VT1000 S
Micropipette Puller	Narishige	PC-10
Imaging Camera	Q Imaging	QIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10	Narishige	PC-10
Glass capillaries	WPI	TW150F-3
Slice hold-down (harp)	Warner Instruments	64-0255
Slice Chamber	Warner Instruments	RC-26
Nonmetallic syringe needle	World Precision Instruments	MF28G67-5
Syringe filters	Nalgene	176-0045
Glue Gun	Home Depot	various
Gas dispersion tube	Ace Glass Inc.	various
Decapitation scissors	Home Depot	100649198
Scalpel Handle #3	World Precision Instruments	500236
Small straight sharp tips scissors	World Precision Instruments	14218
Vessel canulation forceps	World Precision Instruments	500453
Curved hemostatic forceps	World Precision Instruments	501288
Economy Tweezers #3	World Precision Instruments	501976-6
Spatula	Fisher Scientific	14357Q
Scooping spatula	Fisher Scientific	14-357Q
Petri dish	Fisher Scientific	08-747B
Filter paper	Lab Depot	CFP1-110
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50%	Sigma Aldrich/various	G1951
Cesium-OH (CsOH) 50%	Sigma Aldrich/various	232041
NaCl, 2.8 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
HEPES, 20 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.4 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mM	Sigma Aldrich/various	T2265
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mM	Sigma Aldrich/various	G4500
KCl, 20 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
HEPES, 10 mM	Sigma Aldrich/various	H3375
EGTA, 0.2 mM	Sigma Aldrich/various	E4378
MgCl2	Sigma Aldrich/various	M8266
Na2GTP, 0.3 mM	Sigma Aldrich/various	G8877
MgATP, 2 mM	Sigma Aldrich/various	A9187
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	P3911
NaCl, 119 mM	Sigma Aldrich/various	S7653
NaH2PO4-H20, 1 mM	Sigma Aldrich/various	S9638
NaHCO3, 26.2 mM	Sigma Aldrich/various	S8875
Glucose, 11 mM	Sigma Aldrich/various	G8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mM	Sigma Aldrich/various	230391
CaCl2-2H20, 2.5 mM	Sigma Aldrich/various	C3881
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments
Additional compounds used for solutions preparation
KOH	various
Kynurenic acid	Sigma Aldrich/various	K3375