This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Endotel hücreleri, kan damarlarının iç çeperini kaplamak ve damar tonu, vasküler geçirgenlik ve yeni damar oluşumu düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Endotel hücre fonksiyon bozukluğu, iskemik kalp hastalığı da dahil olmak üzere birçok kardiyovasküler hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde rol oynar. fonksiyonu ve koroner endotel hücrelerinin karakterizasyonu incelemek için, hücre izolasyonu ilk adımdır ve daha sonraki deneyler yüksek saflıkta ve miktarını gerektirir. Bu protokol, yetişkin fare koroner endotel hücrelerini izole etmek için etkili bir yöntem tarif eder. Fare kalp disseke ve küçük parçalar halinde kıyılmış. dispaz ve kolajenaz II kullanılarak kalbin sindirimden sonra hücreler yıkanır ve anti-CD31 antikoru ile konjuge edilmiş, manyetik boncuklar ile inkübe edildi. endotel hücreleri ile boncuk yıkanmış birkaç kez ve görüntüleme ve moleküler biyoloji experime dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda kullanıma hazırNTS. Verimli izolasyon% 90'ın üzerinde saflıkta tek yürek başına yaklaşık 10 4 hücre verir.
Çeşitli kardiyovasküler hastalıklar ve metabolik bozukluklar fare modellerinde hastalarda bulunan benzer fizyolojik ve moleküler değişiklik taşımaktadır. Ayrıca, farelerin genetik değişim bizi hastalıkların gelişimi ve ilerlemesinde belirli genlerin patojenik rolünü araştırmak için olanak sağlayan güçlü bir araçtır. Günümüzde, hücre tipi-özgü gen in-tak ya -kasa farenin kolayca farenin gerçek genetik olarak tadil edilmiş olup olmadığını belirlemek için ilk adımdır spesifik hücre tipleri çok laboratuar ve mRNA ölçümü ve protein seviyeleri üretilir.
Endotel endotel hücreleri (EC) hatları, iç damar duvarı ince bir tek tabakadır. Endotel hücreleri, vasküler tansiyon, damar geçirgenliğini ve yeni damar oluşumu 1,2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Endotel disfonksiyonu, birçok patolojik durumlarda ve endotel fonksiyonu değişiklikleri bir işaretidir çeşitli araç yol açabilir olduğunukardiyovasküler hastalıklar 3,4. Fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında endotel hücrelerinin işlevini incelemek böylece önemlidir.
Orada ECS 5-8 izole etmek çeşitli yolları vardır ve izolasyon yöntemi doku ve türlerin kullanılacak olan bağlı optimize edilmiş olması gerekir. Farklı dokulardan EC yüzey belirteçleri ile ilgili ve protein ekspresyonu 9 heterojenlik ileri düzey bir olmasıdır. endotel hücrelerinin Başarılı izolasyonu genellikle zor olabilir ve eğitim ve uygulama bir dereceye gerektirir. elde kez, bu protokolde öngörülen izolasyon yöntemi istikrarlı ve verimli olduğunu kanıtlamaktadır.
Bu yöntemin genel amacı yüksek kalite ve miktar fare koroner EC (MCECs) elde etmektir. Bir kalp toplanan hücrelerin miktarı diğer teknikleri kullanarak, diğer dokulardan elde hücrelerden daha az olsa da, bu teknik yine de bahsi sağlarter kalitesi. Elde edilen popülasyonda endotel hücrelerinin saflığı% 90 daha büyüktür. Bu nedenle, bu teknik, hücre görüntüleme gibi tamamen izole edilmiş endotel hücreleri kullanan uygulamalar için ideal olacaktır.
Araştırmada en yaygın olarak kullanılan endotel hücreleri nedeniyle rahatlık ve kültür kolaylığı, insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVECler) vardır. Bununla birlikte, bir çok araştırma diğer özel organlar 10 arasında endotel hücrelerinin izolasyonu ile elde edilen fizyolojik modelin varlığını gerektirir. Endotel hücreleri, kalp dokusu hücrelerinin çok küçük bir popülasyonu oluşturan; onların izolasyon ve kültür çok zor olabilir kanıtlayabilirim.
<p class="jove_c…The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Sağlık (A. Makino için HL115578) National Institutes of gelen hibe ile desteklenmiştir.
BSA | Sigma | A3311-10G | |
EDTA | Fisher | BP120-500 | |
HBSS | Fisher | SH3026801 | |
Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
M199 | Fisher | MT10060-CV | |
Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
EGS | BD | 356006 | Corning |
Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |