이 프로토콜의 목적은 관상 동맥에서 뮤린 주 혈관 평활근 세포의 분리 및 배양 방법 (혈관 평활근 세포)을 보여주는 것이다. 혈관 평활근 세포가 분리되고 나면, 이들은 많은 표준 배양 기술에 사용될 수있다.
격리와 큰 혈관에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)의 문화가 잘 확립하는 동안, 우리는 관상 동맥에서 분리하고 배양 혈관 평활근 세포 노력했다. 완전한 대동맥 아치 하트 제거 소화 용액 콜라겐 타입 II, 0.1 ㎎ / ㎖ 대두 트립신 억제제 및 1 M CaCl2를 300 단위 / ㎖를 함유하는 역행 랑겐 돌프 통해 관류 하였다. 관류 도금 배지에서 재현 탁하고 원심 분리하여 펠렛을 90 분 동안 15 분 간격으로 수집하고, 조직 배양 접시에서 배양 하였다. 혈관 평활근 세포는 SM22α의 존재, α-SMA 및 vimentin에 의해 특징했다. 이 기술을 사용하는 중요한 장점 중 하나는 마우스의 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포를 분리 할 수있는 능력이다. 세포가 이용 될 수있는 애플리케이션들을 제한 할 수 얻어지는 세포의 소수 절연 관상 혈관 평활근 세포는 잘 확립 세포 배양 기술과 ASSA 다양한 사용할 수 있지만YS. 유전자 변형 생쥐에서 혈관 평활근 세포를 조사 연구는 구조 – 기능 및 혈관 병변과 관련된 신호 전달 과정에 대한 자세한 정보를 제공 할 수 있습니다.
이 방법의 목적은 세포 배양 및 표준 세포 배양 분석에 사용하기 위해 뮤린 관상 동맥에서 혈관 평활근 세포 (혈관 평활근 세포)를 분리한다. 우리는 당뇨병에서 혈관 재 형성의 분자 메커니즘을 평가하기 위해이 기술을 개발했다. 우리는 이전에 당뇨병 (1)의 모델 db / db 마우스에서의 관상 동맥에 중격 비대 리모델링 내측보고 하였다. 때문에 쥐의 중격 관상 동맥에있는 조직의 제한된 양, dB / dB 및 제어 마우스에서 단백질의 변화 (예를 들어, 웨스턴 블롯을) 조사 표준 실험 방법은 가장 어렵습니다. 또한, 우리는 이전에 안지오텐신 수용체 차단제 (ARB)의 로사 르탄이 dB / db 마우스 2에서 관찰 된 리모델링을 감소하는 것으로 나타났습니다. 따라서, 관상 동맥에서 주요 혈관 평활근 세포의 분리는 우리가 더 contribu 수있다 당뇨병 쥐의 혈관 평활근 세포 표현형의 변화 또는 신호 활성화 경로를 조사 할 수 있습니다이상 관상 동맥 세동맥 리모델링에 팅.
많은 연구가 아니라 각 특정 혈관 침대에서보다 쥐 대동맥에서 고립 된 혈관 평활근 세포를 사용하여 표준 신호 전달 경로를 밝혀왔다. 그러나, 우리는 다를 수 있습니다 각 혈관 침대에서 혈관 평활근 세포를 제안, 혈관 침대에게 관상 동맥, 대동맥의 특정 리모델링 및 dB / db 마우스 (1)의 장간막 순환을 증명하고있다. 따라서, 더 혈관 평활근 세포의 각 세트에서 일어나는 병리학 적 변화를 이해하기 위하여 각 혈관계의 혈관 평활근 세포를 분리 할 필요가있다. 분리 및 대동맥 혈관 평활근 세포를 배양하기위한 다른 방법의 과다가 있습니다. 그러나, 현재, 마우스 관상 동맥 3에서 혈관 평활근 세포의 분리에 게시 된 하나의 연구가있다. 탱 등은. 마우스 관상 동맥의 혈관 평활근 세포를 분리하는 방법을보고하는 첫번째이었다; 그러나 상당히 프로토콜을 수정 한 또한 내피 CEL 절연로서LS. 다른 연구소는 탱 등의 등의 프로토콜을 사용하고 있습니다. 관상 동맥 근육 세포와기도 평활근 세포 4,5를 분리 할 수 있습니다. 우리가 통합 한 변경은 높은 관상 동맥의 혈관 평활근 세포에 대한 풍부한 세포의 인구를 얻을 것입니다.
분리 된 포유 동물의 심장, 또는 랑겐 돌프 기술의 역 행성 관류는 오스카 랑겐 돌프에 의해 1897 6 년에 설립되었으며, 여전히 널리 심장 혈관 세포의 분리를 위해 오늘 사용된다. 현대 쥐의 유전자 변형의 발전과 함께 여기에 제시된 기술은, 관상 순환에서 혈관 평활근 세포의 분자 행동 가까이 조사를위한 유용한 도구를 제공합니다.
이 연구의 목적은 쥐 하트 매끄러운 관상 혈관의 수율을 높이기 위해 기존의 셀 분리 프로토콜을 적용 하였다. 혈관 평활근 생물학에서 선구적인 작업의 대부분은 배양 된 쥐의 대동맥 평활근 세포로 하였다. 이 연구는 혈관 평활근 세포의 성장, 마이그레이션 및 비대 (7)을 제어하는 분자 메커니즘의 기초 지식을 제공했다. 필드가 진행하지만, 그것은 VSMC 표현형 및 기능 혈관계 특정 요인…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 (PAL 및 K99HL116769 AJT에하는 R01HL056046) 국립 보건원에서 지원하고, 전국 어린이 병원에서 연구소 (PAL 및 AJT에)했다.
Fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-071 | |
HEPES 1M solution | Fisher | MT-25-060 | |
Primocin – 20mL | Invivogen | ant-pm-2 | |
DMEM (High Glucose, Sodium Pyruvate, L-Glutamine) | Life Technologies | 11995-065 | |
MEM NEAA 10 mM 100X | Life Technologies | 11140-050 | |
L-Glut 200 mM – Gibco | Life Technologies | 25030-081 | |
Sterile Cell Strainer 100um nylon mesh | Fisher | 22363549 | |
Nunclon Polystrene dish with lid, sterile, 35 mm | Fisher | 12-565-91 | |
Harvard Apparatus black silk suture 5-0 | Fisher | 14-516-124 | |
Collagenase Type-2 | Worthington Biochemical | LS004176 | |
Soybean Trypsin Inhibitor 25mg | Sigma | T6522 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (clear) | Life Technologies | 14175-103 | |
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid (phenol red) | Life Technologies | 14170-161 | |
5.0 ml heating coil with degassing bubble trap | Radnoti | 158830 | |
11 plus pump | Harvard Apparatus | 70-2208 | |
Circulating heated water pump | any brand will work |