Een snelle methode voor bloedverwerkende de opbrengst aan plasma peptide niveaus in bloed verhogen
Summary
RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen en hogere opbrengsten peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm. Daarom zal deze methode een waardevol instrument in peptide onderzoek.
Abstract
Onderzoek op het gebied van de voedselinname regelgeving wordt steeds belangrijker. Dit omvat vaak het meten van peptiden de voedselopname. Voor de juiste bepaling van de concentratie van een peptide moet stabiel tijdens bloedbewerking zijn. Dit is echter niet voor meerdere peptiden die snel worden afgebroken door endogene peptidasen. Onlangs hebben we een bloedverwerkend werkwijze gebruik R educed temperaturen cidification A, P rotease remming I sotopic exogene controles en D ilution (RAPID) voor gebruik bij ratten. Hier hebben we deze techniek voor gebruik bij mensen vastgesteld en onderzocht herstel moleculaire vorm en circulerende concentratie van voedselinname regulerende hormonen. De snelle werkwijze aanzienlijk verbeterd herstel voor 125-gemerkte somatostatine-28 (+ 39%), glucagon-achtige peptide-1 (+ 35%), acyl ghreline en glucagon (+ 32%), insuline en kisspeptin (+ 29% ) nesfatin-1 (+ 28%), leptine(+ 21%) en peptide YY 3-36 (+ 19%) in vergelijking met standaard verwerking (EDTA bloed op ijs, p <0,001). Hoge prestatie vloeistofchromatografie toonde de elutie van endogene acyl ghreline op de verwachte positie RAPID verwerking, terwijl na standaardverwerking 62% van acyl ghreline werd afgebroken waardoor een eerdere piek waarschijnlijk vertegenwoordigen desacyl ghreline. Na een snelle verwerking van de acyl / desacyl ghrelin verhouding in het bloed van een normaal gewicht was 1: 3 ten opzichte van 01:23 volgende standaard verwerking (p = 0,03). Ook endogene kisspeptin niveaus waren hoger na RAPID in vergelijking met standaard verwerking (+ 99%, p = 0,02). RAPID bloed verwerkingsmethode kan worden gebruikt bij mensen, levert hogere peptide niveaus en maakt de beoordeling van de juiste moleculaire vorm.
Introduction
In het licht van de wereldwijde toenemende prevalentie van obesitas 1,2, wordt onderzoek op het gebied van de voedselinname regelgeving steeds belangrijker. Terwijl tot nu toe slechts één peptide is bekend dat de omtrek opgesteld en centraal werkende voedselinname, namelijk ghreline 3 stimuleren, in de afgelopen decennia is een groot aantal peptiden geïdentificeerd die verminderen voedselinname, bijv. leptine, peptide YY (PYY) en glucagon-achtig peptide-1 (GLP-1) en insuline 4, Daarom is in studies naar de regulatiemechanismen van honger-peptide niveaus worden vaak beoordeeld en tegelijkertijd wordt aangenomen dat het peptide bestudeerde stabiel en teruggewonnen in hoge opbrengsten bij plasma formatie. Echter, vaak is dit niet het geval is door snelle endogene afbraak zoals eerder getoond bijv. ghreline die gedegradeerd van acyl ghreline tot 5 desacyl. Daarom hebben we onlangs beschreef de snelle methode voor het bloed proceszingen bij ratten in dienst R educed temperaturen, A cidification, P rotease inhibitie, ik sotopic exogene controles en D ilution 6. Deze methode verbeterd herstel van 6 11 van 12 peptiden getest en toegestaan voor het bepalen van de juiste circulerende moleculaire vorm in vergelijking met standaard Bloedverwerkingsfilter (EDTA bloed op ijs). Deze werkwijze is gebruikt in verscheidene latere studies 7-12 voor de detectie van ghreline en corticotropine releasing factor 13. Daarom is de werkwijze nuttig voor peptide onderzoek bij knaagdieren aangetoond. Echter, aangezien knaagdieren studies zijn niet altijd te vertalen naar een andere soort, de methode moet worden vastgesteld voor het gebruik in het menselijk bloed ook.
Het doel van het onderhavige onderzoek was de snelle werkwijze voor het bloedverwerkende testen bij mensen in vergelijking met standaard bloedbewerkingsprocedure, EDTA bloed op ijs, die algemeen wordt aanbevolen 14 en vaak used in de klinische en onderzoek instellingen. We testten het herstel van een selectie van 125 I-gelabelde peptiden die betrokken zijn bij de regulatie van voedselinname waaronder gevestigde peptiden evenals nieuwe kandidaten onlangs voorgesteld om een rol spelen bij het voeden van regulering spelen (effecten op voedselinname zijn weergegeven in tabel 1) na verwerking met beide methoden. Hormonen werden gekozen om peptiden van verschillende lengte en lading (tabel 2) te vertegenwoordigen. Bovendien is het voor ghrelin onderzochten we de moleculaire vorm (s) naar aanleiding van de standaard en snelle methode. Tenslotte onderzochten we endogeen ghreline (acyl en desacyl ghreline) en kisspeptin niveaus, een peptide onlangs voorgesteld een rol in de regulering van voedselinname 15,16 volgende RAPID of standaard bewerking beschikt. Daarnaast onderzochten we ook deze peptide niveaus in een populatie van patiënten met een breed scala van body mass index (variërend 10,2-67,6 kg / m 2) possib studerenle verschillen met betrekking tot chronisch gewijzigd lichaamsgewicht.
Diagnose, Evaluatie en Plan:
studie deelnemers
Alle deelnemers aan de studie werden onlangs in het ziekenhuis opgenomen patiënten (inclusie was binnen twee dagen na opname in het ziekenhuis) van de afdeling Psychosomatische Medicine in Charité-Universitätsmedizin Berlijn en gaven schriftelijk informed consent. Om enige impact van gender enige vrouwelijke patiënten geïncludeerd te voorkomen. Een totaal van 42 patiënten namen deel aan het onderzoek en werden verdeeld in drie groepen: normaal gewicht (BMI 18,5-25 kg / m 2, n = 12), anorexia nervosa (BMI <17,5 kg / m 2, n = 15) en obesitas (BMI> 30 kg / m 2, n = 15). Anorexia en obese patiënten warengediagnosticeerd volgens de International Classification of Diseases-10 en het ziekenhuis voor gewichtstoename (anorexia nervosa) of gewichtsvermindering (obesitas), respectievelijk. Alle normaal gewicht patiënten werden uitsluitend in het ziekenhuis als gevolg van somatoforme klachten zonder relevante somatische aandoeningen. Patiënten met gastro-intestinale somatoforme symptomen of een voorgeschiedenis van gastro-intestinale chirurgie werden uitgesloten. Uitsluitingscriteria omvatte ook een leeftijd <18 jaar, de huidige zwangerschap en onbehandelde psychotische aandoeningen. Bloedafname uitgevoerd op dag 2 of 3 na ziekenhuisopname voor het ontvangen dieetbehandeling voor het vergroten of verkleinen lichaamsgewicht, respectievelijk. Antropometrische parameters werden op dezelfde dag.
Protocol
Representative Results
Discussion
We meldden eerder dat de snelle methode voor de verwerking van bloed verbeterde de recovery voor 11/12 peptides in vergelijking met standaard verwerking bloed bij ratten 6. In deze studie hebben we aangetoond dat deze methode ook geschikt voor gebruik bij mensen. Na snelle verwerking werd het herstel voor 9 van 9 125I-gemerkte peptiden getest dan standaard Bloedverwerkingsfilter (EDTA bloed op ijs). De waargenomen verbetering varieerde 19-39% die van belang kan zijn, vooral onder omstandigheden wan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door de Duitse Research Foundation STE 1765 / 3-1 (AS) en het Duitse ministerie van Onderwijs en Onderzoek 03IPT614A (CG). Wij danken Reinhard Lommel en Petra Busse voor hun uitstekende technische ondersteuning en Karin Johansson en Christina Hentzschel voor hulp bij de organisatie en uitvoering van antropometrische metingen
Materials
| diprotin A | Peptides International, Louisville, KY, USA | IDP-4132 | |
| E-64-d | Peptides International, Louisville, KY, USA | IED-4321-v | |
| antipain | Peptides International, Louisville, KY, USA | IAP-4062 | |
| leupeptin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ILP-4041 | |
| chymostatin | Peptides International, Louisville, KY, USA | ICY-4063 | |
| Sep-Pak C18 cartridges | Waters Corporation, Milford, MA, USA | WAT051910 | 360 mg, 55-105 µm |
| acyl-ghrelin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9088-HK | Radioactive |
| GLP-1 | Millipore, Billerica, MA, USA | 9035-HK | Radioactive |
| glucagon | Millipore, Billerica, MA, USA | 9030 | Radioactive |
| insulin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9011S | Radioactive |
| leptin | Millipore, Billerica, MA, USA | 9081-HK | Radioactive |
| kisspeptin-10 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-048-56 | Radioactive |
| nesfatin-1 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-003-26 | Radioactive |
| PYY3-36 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-059-02 | Radioactive |
| somatostatin-28 | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | T-060-16 | Radioactive |
| ZORBAX Rapid Resolution HT SB-C18 column | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | 822700-902 | 2.1 x 50 mm, 1.8 µm |
| Agilent 1200 LC | Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA | HPLC, several components, therefore no single catalog number | |
| Kisspeptin RIA | Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA | # RK-048-56 | Radioactive |
| Total ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRT-89HK | Radioactive |
| Active ghrelin RIA | Millipore, Billerica, MA, USA | # GHRA-88HK | Radioactive |
| SigmaStat 3.1 | Systat Software, San Jose, CA, USA | online download |
References
- Finucane, M. M., et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 9.1 million participants. Lancet. 377 (9765), 557-567 (2011).
- James, W. P. The epidemiology of obesity: the size of the problem. J Intern Med. 263 (4), 336-352 (2008).
- Stengel, A., Taché, Y. Gastric peptides and their regulation of hunger and satiety. Curr Gastroenterol Rep. 14 (6), 480-488 (2012).
- Hussain, S. S., Bloom, S. R. The regulation of food intake by the gut-brain axis: implications for obesity. Int J Obes (Lond). 37 (5), 625-633 (2013).
- Hosoda, H., et al. Optimum collection and storage conditions for ghrelin measurements: octanoyl modification of ghrelin is rapidly hydrolyzed to desacyl ghrelin in blood samples). Clin Chem. 50 (6), 1077-1080 (2004).
- Stengel, A., et al. The RAPID method for blood processing yields new insight in plasma concentrations and molecular forms of circulating gut peptides. Endocrinology. 150 (11), 5113-5118 (2009).
- Stengel, A., et al. Lipopolysaccharide differentially decreases plasma acyl and desacyl ghrelin levels in rats: Potential role of the circulating ghrelin-acylating enzyme GOAT. Peptides. 31 (9), 1689-1696 (2010).
- Stengel, A., et al. Cold ambient temperature reverses abdominal surgery-induced delayed gastric emptying and decreased plasma ghrelin levels in rats. Peptides. 31, 2229-2235 (2010).
- Stengel, A., et al. Central administration of pan-somatostatin agonist ODT8-SST prevents abdominal surgery-induced inhibition of circulating ghrelin, food intake and gastric emptying in rats. Neurogastroenterol Motil. 23 (7), e294-e308 (2011).
- Stengel, A., et al. Abdominal surgery inhibits circulating acyl ghrelin and ghrelin-O-acyltransferase levels in rats: role of the somatostatin receptor subtype 2. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301, G239-G248 (2011).
- Wang, L., et al. Intravenous injection of urocortin 1 induces a CRF2 mediated increase in circulating ghrelin and glucose levels through distinct mechanisms in rats. Peptides. 39, 164-170 (2013).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Wang, L., Taché, Y. Orexigenic response to tail pinch: role of brain NPY(1) and corticotropin releasing factor receptors. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 306 (3), R164-R174 (2014).
- Goebel, M., Stengel, A., Wang, L., Reeve, J., Taché, Y. Lipopolysaccharide increases plasma levels of corticotropin-releasing hormone in rats. Neuroendocrinology. 93 (3), 165-173 (2011).
- Banfi, G., Salvagno, G. L., Lippi, G. The role of ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) as in vitro anticoagulant for diagnostic purposes. Clin Chem Lab Med. 45 (5), 565-576 (2007).
- Stengel, A., Wang, L., Goebel-Stengel, M., Taché, Y. Centrally injected kisspeptin reduces food intake by increasing meal intervals in mice. Neuroreport. 22 (5), 253-257 (2011).
- De Bond, J. A., Smith, J. T. Kisspeptin and energy balance in reproduction. Reproduction. 147 (3), R53-R63 (2014).
- Wren, A. M., et al. Ghrelin enhances appetite and increases food intake in humans. J Clin Endocrinol Metab. 86 (12), 5992 (2001).
- Schulman, J. L., Carleton, J. L., Whitney, G., Whitehorn, J. C. Effect of glucagon on food intake and body weight in man. J Appl Physiol. 11 (3), 419-421 (1957).
- Steinert, R. E., Poller, B., Castelli, M. C., Drewe, J., Beglinger, C. Oral administration of glucagon-like peptide 1 or peptide YY 3-36 affects food intake in healthy male subjects. Am J Clin Nutr. 92 (4), 810-817 (2010).
- Dewan, S., et al. Effects of insulin-induced hypoglycaemia on energy intake and food choice at a subsequent test meal. Diabetes Metab Res Rev. 20 (5), 405-410 (2004).
- Schlogl, M., et al. Increased 24-hour ad libitum food intake is associated with lower plasma irisin concentrations the following morning in adult humans. Appetite. 90, 154-159 (2015).
- Heymsfield, S. B., et al. Recombinant leptin for weight loss in obese and lean adults: a randomized, controlled, dose-escalation trial. JAMA. 282 (16), 1568-1575 (1999).
- Shimizu, H., et al. Peripheral administration of nesfatin-1 reduces food intake in mice: the leptin-independent mechanism. Endocrinology. 150, 662-671 (2009).
- Batterham, R. L., et al. Inhibition of food intake in obese subjects by peptide YY3-36. N Engl J Med. 349 (10), 941-948 (2003).
- Shibasaki, T., et al. Antagonistic effect of somatostatin on corticotropin-releasing factor-induced anorexia in the rat. Life Sci. 42 (3), 329-334 (1988).
- Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Taché, Y., Reeve, J. R. The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides. Anal Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).
- Smets, E. M., et al. Decreased plasma levels of metastin in early pregnancy are associated with small for gestational age neonates. Prenat Diagn. 28 (4), 299-303 (2008).
- Kojima, M., et al. Ghrelin is a growth-hormone-releasing acylated peptide from stomach. Nature. 402 (6762), 656-660 (1999).
- Stengel, A., Yin Taché, Y., Yang, the Gastric X/A-like Cell as Possible Dual Regulator of Food Intake. J Neurogastroenterol Motil. 18 (2), 138-149 (2012).
- Inhoff, T., et al. Desacyl ghrelin inhibits the orexigenic effect of peripherally injected ghrelin in rats. Peptides. 29, 2159-2168 (2008).
- Hirayama, H., et al. Contrasting effects of ghrelin and des-acyl ghrelin on the lumbo-sacral defecation center and regulation of colorectal motility in rats. Neurogastroenterol Motil. 22 (10), 1124-1131 (2011).
- Horikoshi, Y., et al. Dramatic elevation of plasma metastin concentrations in human pregnancy: metastin as a novel placenta-derived hormone in humans. J Clin Endocrinol Metab. 88 (2), 914-919 (2003).
- Yang, Y. U., Xiong, X. Y., Yang, L. I., Xie, L., Huang, H. Testing of kisspeptin levels in girls with idiopathic central precocious puberty and its significance. Exp Ther Med. 9 (6), 2369-2373 (2015).
- Hosoda, H., Kojima, M., Matsuo, H., Kangawa, K. Ghrelin and des-acyl ghrelin: two major forms of rat ghrelin peptide in gastrointestinal tissue. Biochem Biophys Res Commun. 279 (3), 909-913 (2000).
- Raff, H. Total and active ghrelin in developing rats during hypoxia. Endocrine. 21 (2), 159-161 (2003).
- Evans, M. J., Livesey, J. H., Ellis, M. J., Yandle, T. G. Effect of anticoagulants and storage temperatures on stability of plasma and serum hormones. Clin Biochem. 34 (2), 107-112 (2001).
- Nabuchi, Y., Fujiwara, E., Kuboniwa, H., Asoh, Y., Ushio, H. The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm Res. 14 (12), 1685-1690 (1997).
- White, A., Handler, P., Smith, E. L. . Principles of Biochemistry. , (1973).
