כאן אנו מראים טסיות אדם מבודדים יכולים לשמש נגיש vivo לשעבר מודל ללמוד עיבודים מטבוליים בתגובה במתחם שאני מעכב rotenone. גישה זו מעסיקה עקיבת איזוטופי וכימות ביחס ידי ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה הנוזלית וניתן ליישם במגוון רחב של עיצובי מחקר.
Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.
מטבוליזם מתפקדת המיטוכונדריה היה מעורב במגוון רחב של מחלות ניווניות של מערכת העצבים כולל, סרטן, ומחלות לב וכלי דם 30. ככזה, במאמץ רב הושם על המאפיינים פגמים מטבוליים שתורמים בהיווצרות המחלה. כרומטוגרפיה-טנדם נוזלי ספקטרומטריית מסה (LC-MS / MS) נחשבת תקן הזהב עבור כימות של analytes מ מטריצות ביולוגיות מורכבות, והוא מועסק לעתים קרובות ללימודים מטבולית 8. עם זאת, כפי שקורה לעתים קרובות עם ללימודי ביו, השיג מודל נגיש ומוגדר היטב רלוונטי מחל אנושיות הוא אתגר.
מחקרים רבים להעסיק שינו מודלים הסלולר עבור לחקור את ההשפעה של xenobiotics או מומים גנטיים על חילוף חומרים תאיים 7,9. תכנות מחדש מטבולית המתרחש בתאי סרטן יכול להציג מבלבלים גורמי 21 ולכן הם לא אידיאליים. בעיות אלה יכולים להיות circumvented עם מודלי תא ראשוניים, למרות קבלת ביומסה מספיק עבור ניתוחים מטבולית יכולה להיות מאתגרת. יתר על כן, את ההשפעה של כמויות גבוהות של אנטיביוטיקה בשימוש בתרבות כבר מסומן כמו מחקרים המיטוכונדריה בלבול פוטנציאלי 16.
טסיות אדם להרשות לעצמו את ההזדמנות לנצל מודל תא ראשוני עם תוכן המיטוכונדריה מספיק מחקרים מטבוליים 5,22,27,32. ראשית, טסיות ניתן לרכוש בקלות, באמצעות דם שואבת מתורמים פרטיים, או בכמויות גדולות מבנקי דם, ולכן לספק מודל שבו גורמים חיצוניים ניתן לשלוט בקלות. שנית, בשל גודלם הזעיר, טסיות ניתן בקלות לבודד מרכיבים אחרים בדם עם עבודת הכנה מינימלית אפילו מינימלית 5 מצויד במעבדות. ראוי לציין, טסיות אינם מכילים גרעינים ולכן יכול לשמש כדי לחקור שינויים בחילוף החומרים באופן עצמאי הרגולציה תעתיק. כאן אנו מראים כיבנוסף כימות היחסית של acyl-אנזים (CoA) thioesters, מערכת טסיות המבודדת יכולה לשמש כדי לבחון מטבוליזם הפחמן. באופן ספציפי, אנו מדווחים על השימוש תיוג מטבולית עם איזוטופ יציב (לא רדיואקטיבי) שכותרתו [13 C 6] -glucose ו [13 C 16] -palmitate לחקור ההתאגדות של [13 C] -הוסף תווית לתוך acetyl- המטבוליט חשוב CoA דרך הגליקוליזה או חמצון חומצות שומן. זה מספק פלטפורמה חזקה, להכליל, צדדי בשל המעורבות הנרחבת של מיני acyl-CoA reductase ב הביוכימיים 13,24 ואת העקיבות של מערכת זו לבחינת משתנים אחרים, כגון עיכוב שאני מורכב עם rotenone 3,33. בנוסף המידע המופיע בפרוטוקול בהמשך, לסקירה נרחבת של האמצעים שננקטו על תיוג איזוטופ ועבור ניתוחים מבוססי LC-MS ניתן למצוא Basu ובלייר 4.
הנה הראינו את התועלת של טסיות מבודדת כפלטפורמה ללימוד מטבוליזם במיטוכונדריה מוטרדת. באופן ספציפי, יש לנו מאופיין הסתגלות מטבולית בתגובת עיכוב שאני מורכב ידי rotenone.
המחקר הנוכחי הרחיב ממצאים שדווחו בעבר על עצם את התפקיד של עיכוב ש…
The authors have nothing to disclose.
אנו מכירים את התמיכה של מענקים NIH P30ES013508 ו T32ES019851.
Reagent | |||
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2 * H2O) | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | 208337 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
13C6-Glucose | Sigma-Aldrich | 389374 | |
Palmitic acid | Cayman | 10006627 | |
13C16-Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | 605573 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Trichloro Acetic Acid | Sigma-Aldrich | T6399 | |
5-Sulfosalicylic Acid | Sigma-Aldrich | 390275 | |
Acetonitirle | Fischer Scientific | A996-4 | (optima) |
Water (H2O) | Fischer Scientific | W7-4 | (optima) |
Formic acid | Fischer Scientific | 85171 | (optima) |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Ethanol | Fischer Scientific | 04-355-222 | |
Methanol | Fischer Scientific | A454-4 | (optima) |
Ammonium Acetate | Fischer Scientific | A639-500 | |
2 mL Eppendorf Tubes | BioExpress | C-3229-1 | |
LC vials (plastic) | Waters | 186002640 | |
10 mL Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 73785-10 | |
Oasis Solid Phase Extraxtion (SPE) Columns | Waters | WAT094225 | |
Pastuer Pipets | Fischer Scientific | 13-678-200 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
CO2 Water-Jacketed Incubator | Nuaire | AutoFlow NU-8500 | |
Triple Quadropole Mass Spectrometer | Thermo Scientific | Finnigan TSQ Quantum | |
HPLC | Thermo Scientific | Dionex Ultimate 3000 | |
Source | Thermo Scientific | HESI II | |
HPLC Column | Phenomenex | Luna C18 | 3 μm particle size, 200 mm x 2 mm |