Ciblage biofilm Associated<em> Staphylococcus aureus</em> Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Summary

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Abstract

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Introduction

Microbes pathogènes peuvent former des biofilms in vivo conduisant à des infections chroniques non actifs ^1. L' infection par le biofilm associé est un facteur de risque grave de procédures médicales qui impliquent l' implantation d'objets étrangers (par exemple, le remplacement des os artificiels, des implants mammaires) ou l'installation des tubes trachéaux ou cathéters urinaires ^2. Dans ces contextes, le traitement anti-infectieux est presque toujours nécessaire que les infections à base de biofilm sont rarement effacés sur leur propre, même chez les personnes immunocompétentes. Staphylococcus aureus est l' un des agents pathogènes les plus fréquemment observés impliqués dans les complications liées à biofilm qui se produisent lors de l'utilisation de dispositifs médicaux invasifs ^3.

Malheureusement, la nature même de biofilms comme une barrière protectrice qui les rend plus résistantes au traitement que les cellules planctoniques ^1,4, et l' évaluation de l' efficacité clinique prédit est un élément essentiel à la fois initialele développement de médicaments, ainsi que la surveillance de la résistance aux médicaments. Il est de plus en plus reconnu que les conditions de laboratoire, axées sur les cultures planctoniques, peuvent ne pas représenter fidèlement la maladie dans le monde réel ^5. Aggravant encore le problème, la réplication des phénotypes biofilm est difficile, et les modèles de biofilm existants sont fastidieux et souffrent de haute inter et intra-essai variabilité ^6. Ainsi, de nombreux chercheurs, par nécessité, par défaut aux dosages cellulaires planctoniques de sensibilité aux médicaments, ce qui pourrait négliger un aspect important de la virulence bactérienne et la maladie.

Nous décrivons ici le protocole de dosage de bactéries, en particulier S. aureus, dans les biofilms pré-cultivés en utilisant une base de ^7,8 à 96 puits de système de biofilm. Bien que le protocole pour la formation de biofilm et de défi suit essentiellement la recommandation du fabricant, nous présentons une méthodologie riche en information alternative pour quantifier la viabilité du bioFilm après la provocation. En bref, les bactéries sont mises en culture dans la plaque de cheville, où les biofilms se forment sur les pions en saillie fixés au couvercle de la plaque. Après la formation du biofilm, les ergots sont légèrement trempées dans le puits d'une plaque fraîche rempli avec du PBS pour éliminer les cellules planctoniques. Le peg-couvercle, avec biofilms attachés, est transféré à une nouvelle plaque de défi, contenant diverses concentrations d'antibiotiques à doser. Après une seconde incubation, les couvercles sont de nouveau retirées, lavées et transférées à une plaque de recouvrement contenant un colorant résazurine, où ils sont soumis à une incubation finale. la conversion résazurine peut être enregistré cinétiquement ou pris comme une lecture du point final après une période de récupération définie. Cette méthode de quantification de la viabilité des biofilms à base de colorant diffère considérablement des UFC (unités formant colonies) fastidieuses méthodologie basée-count décrit dans le protocole original ^7. OD ₆₀₀ mesures de la plaque de défi de la drogue et la résazurine cinétique de conversion servent de viabilité de lectureouts de planctoniques et biofilm cellules, respectivement, offrant une information riche et techniquement simple test rapide, fiable, pour la survie de biofilm.

Protocol

1. biofilm Initiation Cultiver une culture de biofilm organisme produisant dans un milieu riche en nutriments. Inoculer Staphylococcus aureus souche Newman dans 10 ml de milieu Mueller-Hinton à partir d' un stock de glycérol. Effectuer tous les travaux impliquant la manipulation de S. aureus avec des gants et dans une enceinte de biosécurité. Incuber pendant 16 heures à 37 ° C sur un agitateur rotatif (100-200 rpm). Déterminer la DO 600 de la culture…

Representative Results

Le dosage de la résazurine est suffisamment sensible pour détecter de manière fiable très peu de cellules viables capables de se répliquer dans un milieu exempt de drogue après la provocation. Dans cette méthodologie, nous définissons le biofilm l'éradication de concentration minimale que la plus faible concentration à laquelle aucune conversion de résazurine est vu dans les 24 heures. Le dosage de la résazurine repose sur des molécules oxydantes présentes dans des cell…

Discussion

Ici, nous avons décrit un dosage de biofilm modifié pour déterminer l' activité d'inhibiteurs testés sur S. biofilms aureus mettant l' accent sur ​​l'état métabolique des cellules de biofilm associé. Alors que l'initiation de biofilm décrit et procédures de contestation des recommandations du fabricant principalement simulées, l'utilisation de résazurine colorant pour détecter et quantifier les cellules associées à un biofilm qui survivent un défi inhibiteur …

Materials

Mueller-Hinton Medium	Oxoid	CM0405	Follow recommendations of manufacturer
RPMI-medium	Corning	17-105-CV
CRPMI	Ref 9		RPMI-1640 medium chelexed for 1h with Chelex 100 resin and then supplemented with 10% unchelexed RPMI-1640
Chelex 100 Resin	Bio Rad	142-2822
MBEC-plates	Innovotech	19111
Resazurin Sodium Salt	Sigma	R7017	800µg/ml in DI water     Filter sterile
Micro Plate Shaking Platform	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3 Plate Reader	Biotek
Gen5 software	Biotek		Recording and analysis of resazurin conversion
Neocuproine	Sigma	N1501	prepare 10 mM stock in 100% Ethanol, store at -80ºC
Copper sulfate	Acros Organics	7758-99-8	prepare a 100 mM stock solution in water, store at 4ºC
Cu-Neocuproine	Self-Made		Generated by mixing equal molarities of neocuproine and copper sulfate. Mix was diluted in CRPMI medium to desired concentration.
Gentamicin	Sigma	G3632-1G