Organ specific sensory neurons are difficult to identify. Fast Blue tracing is used to identify nodose neurons innervating the airways for cell sorting. Sorted nodose neurons are used to extract high quality ribonucleic acid (RNA) for sequencing. Using this protocol, gene expression of airway specific neurons is determined.
עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של הנוירונים מביאים אלה ממוקמים בתוך הגרעינים החושיים. גרעינים חושיים מעצבבי איבר או חלק מסוים של הגוף. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים. גרעיני trigeminal ממוקמים הגולגולת המעצבבים את הפנים, ואת דרכי נשימה עליונות. afferents מחנק של הגרעינים nodose להאריך ברחבי הבטן, הלב והריאות. הנוירונים nodose לשלוט מערך מגוון של פונקציות כגון: קצב הנשימה, גירוי בדרכי הנשימה, שיעול ורפלקסים. לכן, כדי להבין ולטפל תפקידם, חשוב לזהות ולבודד תת-אוכלוסיות עצביות ספציפיות דרך נשימה. בשנת העכבר, את דרכי הנשימה נחשפות לצבוע נותבו ניאון, מהיר כחולה, לאיתור מדרדר של נוירון nodose ספציפי דרך נשימהים. גרעיני nodose הם ניתקו ותא מופעל קרינה (FAC) מיון משמש לאיסוף תאי צבע חיוביים. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) מופקת תאים חיוביים לצבוע עבור סידור הדור הבא. באמצעות דרכי הנשימה בשיטה זו ביטוי גנים עצבי ספציפי נקבע.
עצבים חושיים transduce תרמית, מכאני, כימי, גירוי מזיק נגרם על ידי שני סוכני אנדוגני וסביבתיים. גופי התא של עצבים מביאים אלה ממוקמים בגרעיני חושי, כגון שורש הגבה, trigeminal, או גרעיני nodose. כל גנגליון חושי מעצבב אזורים ספציפיים בגוף ומכיל תאי מעצבבי איברים ורקמות נפרדים בתוך אזור זה. למשל, הגרעינים השורש הגבי (DRG) ממוקמים עמוד השדרה ולהרחיב תהליכים בכל הגוף והגפיים, בעוד הגרעינים trigeminal ממוקמים בגולגולת, המכיל נוירונים המעצבבים את הפנים, העיניים, קרומי המוח או העליון דרכי הנשימה 1, 2. גרעיני nodose של העצב התועה ממוקמים בצוואר מתחת הגולגולת מכילים גופי תא שמרחיבים סיבים עצב לאורך כל מערכת העיכול, הלב ודרכי נשימה תחתונה וריאות 3. אצל בני האדם גנגליון nodose עומד בפני עצמו, עם זאת, העכבר הוא התמזגעם גנגליון הצוואר, אשר גם מעצבב ריאות 4. גנגליון התמזג זה נקרא לעתים קרובות צוואר / nodose מורכב, גנגליון המחנק, או פשוט גנגליון 5 nodose. הנה, זה נקרא גנגליון nodose.
סיבים מביאים של nodose להעביר מידע מן הקרביים לגרעין של הדרך הבודדה (NTS) בגזע המוח. קלט חושי אל גנגליון ייחודי זה שולט מערך מגוון של פונקציות, כגון מעי תנועתיות 6, קצב לב 7, נשימת 8,9, ותגובות נשימה מופעלות מגרות 10,11. עם המגוון הזה של פונקציות ואיברים מעוצבבים, חשוב למקד ולבודד subpopulations איבר ספציפי של גנגליון nodose כדי ללמוד מסלולים עצביים הפרט. עם זאת, בהתחשב בגודל הקטן של nodose ואת המספר המוגבל של נוירונים הוא מכיל זו אינה משימה טריוויאלית. כל עכבר nodose גנגליון מכיל בערך 5,000 נוירונים 12בנוסף אוכלוסייה נרחבת של תאים תומכים בלוויין. של 5,000 הנוירונים nodose, רק 3 – 5% innervate את דרכי הנשימה. לכן, כל שינוי פונקציונלי, מורפולוגיים או מולקולרי בתוך הנוירונים דרכי הנשימה-innervating, עקב גירוי בדרך נשימה או פתולוגיות, יאבד גנגליון nodose הצפוף.
כדי לפתור בעיה זו, פותחה שיטה לזהות ולבודד נוירונים המעצבבים את דרכי הנשימה. דרכי האוויר נחשפו לצבוע נותב ניאון כדי לזהות את הנוירונים nodose innervating שלאחר מכן. כחול מהיר נאסף על ידי נוירונים ונוסע במהירות גופי התא שלהם איפה זה נשמר עד שמונה שבועות 13 – 15. לאחר הזיהוי, פרוטוקול עדין, אך יעיל, דיסוציאציה שימש לשמר תיוג לצבוע כדאיות התא עבור התא מופעל ניאון (FAC) מיון. תאים ממוינים משמשים כדי לחלץ חומצה ריבונוקלאית באיכות גבוהה (RNA) כדי לקבוע ביטוי גנים או fאו ניתוח מולקולרי במורד אחר. פרוטוקול זה מספק טכניקה יעילה וחזקה לבודד עצב סנסורי מעצבבי רקמה של עניין.
פרוטוקול זה מתאר שיטה למקד נוירונים דרכי הנשימה-innervating בגרעיני nodose של העצב התועה. לאחר שכותרתו, הגרעינים הם ניתקו בעדינות לשמר מספרים סלולריים באופן המיטבי את כדאיות. נוירונים אלה הם אז FAC מסודר ישירות למאגר תמוגה ו- RNA מופק. המשמעות של פרוטוקול זה היא היכולת למקד, לבוד…
The authors have nothing to disclose.
נתמך על ידי NIH מענק R01HL105635 כדי Sej. המחברים מבקשים להודות דייגו V. Bohórquez עבור ייעוץ טכני. אנו מודים גם ר 'איאן קאמינג לקבלת סיוע טכני וביצוע cytometry הזרימה במתקן המשאב המשותף cytometry זרימת מכון מחקר אדם חיסון Duke (Durham, NC). Cytometry זרימה בוצעה במעבדת Biocontainment האזורית באוניברסיטת דיוק שקיבלה תמיכה חלקית לבנייה מן המכונים הלאומיים לבריאות, המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות (UC6-AI058607).
Fast Blue | Polysciences, Inc. | 17740-2 | stock 2 mg/ml in water |
NeuroTrace 530/615 red Nissle stain | Life Technologies | N21482 | |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Ca and Mg free | Gibco | 14190-144 | |
Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
glutamine (Glutamax) | Gibco | 35050-061 | |
HEPES | Gibco | 15630-080 | |
N2 | Gibco | 17502-048 | |
B27 (no vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
Nerve Growth Factor (NGF) | Sigma | N6009 | stock 50 µg/ml in PBS/10% FBS |
digestion enzyme, Liberase DH Research Grade | Roche | 5401054001 | stock 2.5 mg/ml in water |
particle solution (Percoll) | Sigma | P1644-25ML | |
Heating block | LabNet | ||
70 um cell strainer | Falcon | 352350 | |
Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-500 | |
RNase free water | Fisher Scientific | BP2484-100 | |
RNase decontamination reagent, RNase AWAY | invitrogen | 10328-011 | |
2-mercaptoethanol | VWR | EM-6010 | |
RNA extraction kit, RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | 74034 | |
DNase kit, RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
DNase | Sigma | D5025-15KU | stock 10 mg/ml in 0.15 M NaCl |
Propidium Iodide | Sigma | P4170-10MG | stock 10 µg/ml in PBS |
Microfluidic electrophoresis system (TapeStation 2200) | Agilent |