Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.
Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.
Ca 2 + es un ion muy importante que se encuentra en abundancia dentro de cada célula en el cuerpo. Tiene un papel importante en muchos diferentes funciones celulares, incluyendo el crecimiento, la proliferación, la migración y apoptosis 1-4. Está bien establecido que el Ca 2+ puede afectar a estos procesos a través de ambas acciones directas e indirectas, y por lo tanto, los cambios en las concentraciones intracelulares normales de este ion puede dar lugar fácilmente a resultados negativos para las células afectadas. La SR se considera como el más grande 2+ tienda intracelular de Ca en la célula 5. Niveles de estado estacionario de Ca2 +, tanto en el SR y el citoplasma normalmente se mantienen a través de un flujo constante dentro y fuera de los canales de Ca2 + -transporting de este orgánulo. Las condiciones de estrés impuestas a las células debido a cualquier tipo de lesión o enfermedad se asocian con cambios significativos en la SR Ca2 + que pasan a tener efectos duraderos en la queALTH de la célula. En el más grave de los casos, la incapacidad de una célula subrayado para recuperar y mantener Ca SR estado estacionario 2+ niveles incluso pueden culminar en la muerte por apoptosis 6-8.
La investigación actual en celulares Ca 2+ dinámica está limitada por el hecho de que pocos estudios orgánulo prueba de Ca 2+ del contenido del almacén directamente 9-11. La práctica más común en cambio consiste en la medición de los niveles de Ca2 + citoplasmáticos como mediciones indirectas de los cambios en el contenido de SR Ca2 + 12-14. En estos experimentos, Ca 2+ se induce comúnmente para ser liberado de la SR a través del uso de agentes farmacológicos que causan el agotamiento de los orgánulos (por ejemplo, thapsigargin). Conclusiones son extraídas con respecto a los cambios SR Ca2 + en base a las fluctuaciones en las concentraciones de Ca 2+ citoplásmicos. A pesar de la capacidad restante para los investigadores extraer las conclusiones en una rotonda manner, este método de medición SR Ca2 + es claramente una forma indirecta de recoger dicha información, con muchas limitaciones relativas a la interpretación de los datos recogidos. Con el fin de evitar esta restricción clara, es necesario medir la cantidad de Ca 2+ se encuentra directamente dentro de la red luminal SR.
Vital para el resultado final de ser capaz de grabar directamente SR niveles intraluminales de Ca2 + son las herramientas de cultivo celular y el indicador de Ca 2+ utilizado. Para los datos de referencia en el manuscrito actual, es importante señalar que CMLV utilizados procedían de una línea celular congelada. Las células se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero de ternero recién nacido (NCS) sobre pasajes 22-26 para los experimentos descritos, se incubaron a una constante de 37 ° C con 5% de CO 2 de suministro. Utilizando el método actual, por ejemplo, las células han sido cultivadas con mucho éxito en una mezcla de proteínas que simula el extracelularentorno de muchos tipos diferentes de tejidos 15. Importante para el éxito a lo largo de la vena de la SR Ca 2+ investigación es el tipo de mezcla de proteína utilizada; en este caso, una variedad bajo factor de crecimiento era necesario para evitar componentes de esta herramienta de afectar a la señalización normal de Ca2 + y movimientos que se producen constantemente dentro de las células de la prueba. Tras el crecimiento con éxito de células de ensayo, el indicador de Ca 2 + también se debe introducir de manera efectiva a estas células cultivadas. Esto ha sido posible mediante el uso de un vector adenoviral que lleva el SR-residente Ca 2+ D1SR indicador. Para lograr una alta eficiencia de la transfección, las células deben ser incubadas con vectores virales durante al menos 36 a 48 horas antes de la formación de imágenes. Esta preparación proporciona una herramienta fiable para medir Ca 2 + transitorios dentro de la luz SR con alta precisión y reproducibilidad.
D1SR indicador utilizado en este protocolo es una variante modificada del D1ER Ca2 + indicator que fue creado originalmente por el laboratorio del Dr. Roger Y. Tsien en la Universidad de California, San Diego, EE.UU. 9,16. El D1ER original, pertenece a una segunda generación de codificados genéticamente Ca 2+ indicadores llamados cameleons que muestran sensibilidades Ca 2 + a través de una gama mucho más amplia (0,5 a 160 mM) en comparación con anteriores Ca 2+ indicadores 9,16. La nueva variante D1SR, una especie de regalo del Dr. Wayne Chen (Universidad de Alberta, Canadá), sin embargo, lleva una secuencia mutante calsecuestrina (en lugar de una secuencia calreticulina como en el D1ER original). El calsecuestrina mutante tiene una reducida unión a Ca2 + que elimina el problema de competir con calsecuestrina endógena en la unión a Ca2 + dentro del lumen 11 SR. El indicador D1SR lleva una proteína fluorescente cian truncada mejorado (CFP) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) que se unen por una proteína de unión que contiene calmodulina modificado (CaM) y M13 (tél péptido de 26 restos de la miosina de cadena ligera quinasa que se une a secuencias CAM). La secuencia de CaM-M13 ha sido modificado para evitar M13 de la unión a calmodulina endógeno. Además, para asegurar la retención de SR, una secuencia calsecuestrina se ha añadido en el extremo 5 'de la PPC 11. Cuando se une a Ca 2 +, el dominio CaM-M13 pasa a través de cambios conformacionales que resultan en un aumento en la transferencia de energía entre la PPC y que flanquean YFP, que se registra como un aumento en la intensidad de la señal de FRET. Por otro lado, cuando la concentración de SR Ca 2 + luminal gotas, el dominio de CaM-M13 pasa a través de cambios conformacionales inversa, lo que resulta en una disminución en la transferencia de energía entre la PPC y YFP flanqueantes, y una caída significativa en la intensidad de la señal FRET .
Este protocolo describe la transfección de CMLV con el adenovirus D1SR para estudiar las concentraciones de Ca2 + en el lumen de la SR. Este método permite la medición directa de Ca 2+ dentro de este orgánulo, así como su movimiento en / fuera de la SR como resultado de la aplicación de diferentes agentes de calcio en movimiento. Este método tiene muchas ventajas para los investigadores que trabajan hacia una comprensión global de cómo los cambios en los niveles de SR y citoplásmicos Ca <…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por fondos de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud [RP-1.112.666 a CVB & ME].
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (high glucose, pyruvate) | Life technologies | 11995-065 | Warm in 37°C water bath before use |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5mL | Corning | 356230 | Keep at -20°C until right before use |
Newborn Calf Serum | Sigma-Aldrich | Keep at -20°C until right before use | |
35mm glass-bottomed plates | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
250 mL 0.2 μM vented blue plug seal cap flask | BD Falcon | 353136 | |
Trypsin/EDTA Solution | Life technologies | 25200056 | Keep at -20°C until right before use |
50 mL Polypropylene Conical Tube | BD Falcon | 352070 | |
D1SR | N/A | N/A | Gift |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8779 | |
Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
Fluo 4-AM | Life technologies | F-23917 | Keep at -20°C until right before use |
1.5 mL Black Microcentrifuge Tubes | Argos Technologies | T7100BK | |
Leica TCS SP5 confocal microscope | Leica Microsystems | ||
Leica Application Suite 2.6.3 (with FRET SE Wizard application) | Leica Microsystems | ||
GraphPad Prism 5.0 | GraphPad Software, Inc. |