Streptomyces are characterized by a complex life cycle that has been experimentally challenging to study by cell biological means. Here we present a protocol to perform fluorescence time-lapse microscopy of the complete life cycle by growing Streptomyces venezuelae in a microfluidic device.
Live-cell imaging of biological processes at the single cell level has been instrumental to our current understanding of the subcellular organization of bacterial cells. However, the application of time-lapse microscopy to study the cell biological processes underpinning development in the sporulating filamentous bacteria Streptomyces has been hampered by technical difficulties.
Here we present a protocol to overcome these limitations by growing the new model species, Streptomyces venezuelae, in a commercially available microfluidic device which is connected to an inverted fluorescence widefield microscope. Unlike the classical model species, Streptomyces coelicolor, S. venezuelae sporulates in liquid, allowing the application of microfluidic growth chambers to cultivate and microscopically monitor the cellular development and differentiation of S. venezuelae over long time periods. In addition to monitoring morphological changes, the spatio-temporal distribution of fluorescently labeled target proteins can also be visualized by time-lapse microscopy. Moreover, the microfluidic platform offers the experimental flexibility to exchange the culture medium, which is used in the detailed protocol to stimulate sporulation of S. venezuelae in the microfluidic chamber. Images of the entire S. venezuelae life cycle are acquired at specific intervals and processed in the open-source software Fiji to produce movies of the recorded time-series.
放線菌は休眠、unigenomic胞子1-3に多細胞、栄養捕捉菌糸体から形態的分化を含む複雑な発達サイクルを特徴とする土壌中に生息する細菌です。
有利な増殖条件下で、典型的なストレプトミセス胞子は、一つまたは二つの生殖管( 図1)を押し出すことによって発芽し始めます。これらの管は、先端延長によって細長く、栄養菌糸として知られる分岐した菌糸のネットワークへと成長します。極性成長と菌糸の分岐が不可欠なタンパク質DivIVAによって指示されます。このコイルドコイルタンパク質は伸びる先端4-7で新しい細胞エンベロープ材料の挿入のために重要であるpolarisomeを、と呼ばれる大きな細胞質複合体の一部です。栄養成長の間に、菌糸のフィラメントは、いわゆるクロス壁8の不定期の形成による区分化になります。これらのクロス壁の形成は、再帖のFtsZ、ほとんどの細菌9における細胞分裂に不可欠であるチューブリンのような細胞骨格タンパク質。 ストレプトマイセスでは、しかし、これらの植物の交差壁が収縮し、細胞-細胞分離につながらない、したがって、菌糸塊が相互接続された合胞体区画のネットワークとして残ります。十分に理解されていない栄養制限及び他の信号に応答して、特殊な気菌糸は栄養菌糸体から脱却し、空気3に成長します。これらの構造の勃起が長いマルチゲノム気菌糸が等しいサイズのunigenomic prespore区画の数十に分けになっている間、開発の生殖期を、開始します。この大規模な細胞分裂事象は、単一胞子形成菌糸2,10内の複数のFtsZリングの同期収縮によって駆動されます。形態学的分化は休眠、厚肉、着色された胞子の放出によって完成されます。
トン "FO:キープtogether.withinページ=" 1 ">ストレプトマイライフサイクルの重要な発生事象は十分1,3を特徴とします。しかし、まだ何の不足などタンパク質の局在ダイナミクス、染色体移動および発生の制御、細胞分裂などの分化を支える細胞内プロセスへの洞察を提供するために、蛍光タイムラプス顕微鏡を用いる細胞生物学的研究があります。 ストレプト開発のライブセルイメージングが原因ライフサイクルの複雑さと、生物の生理学的特性の挑戦でした。栄養成長と胞子形成隔形成の初期段階でのこれまでの研究では、酸素透過イメージングチャンバーを採用し、または顕微鏡ステージ11-15上のストレプトミセスセリカラーのアガロースサポート成長しています。これらの方法は、しかしながら、多くの要因によって制限されます。一部のシステムでは、唯一の細胞増殖ANの短期的なイメージングを可能にします細胞の前にDの蛍光タンパク質は、不十分な酸素供給に苦しむかによる菌糸の開発の3次元パターンに焦点面の外に成長します。長期的なイメージングが可能である場合には、アガロースパッド上で細胞を培養すると、細胞が代替増殖またはストレス条件に曝露することができないため、実験の柔軟性を制限し、アガロースパッドにおける媒体からのバックグラウンド蛍光が大幅に弱い蛍光を監視する能力を制限します信号。
ここでは、優れた精度と感度との完全なストレプトマイライフサイクルの生細胞イメージングのためのプロトコルについて説明します。蛍光広視野顕微鏡(図2)に接続されたマイクロ流体デバイスにストレプトミセスを成長させることにより、私たちは今までの30時間の時間をかけて発芽、栄養成長と胞子形成隔壁形成をモニターすることができます。これは非常に新しいモデル生物ストレプトミセスの使用によって促進されます</em>のベネズエラは、それは、液体培養でほぼ完全に胞子形成し、それによって、古典的なモデル種S.の限界を克服するため、固形培地16-20にのみ胞子形成コエリカラー 、。栄養成長と胞子形成を視覚化するために、我々を共発現は、蛍光細胞極性マーカーDivIVAと重要な細胞分裂タンパク質のFtsZのバージョンをタグ付け。
我々が正常マイコバクテリア、 大腸菌 、 コリネバクテリウム・グルタミカム、枯草菌および酵母21-25のために使用された市販のマイクロ流体デバイスを使用しています。システムは、単一の焦点面に細胞を捕捉し、異なるリザーバからの培養培地の連続的なかん流を制御することができます。詳細なプロトコルでは、我々はSを露出させるためにこの機能を活用します胞子形成を促進するための栄養ダウンシフトに栄養菌糸体をベネズエラ 。
プロトコルデスクライブ全体ストレプトマイライフサイクルの生細胞イメージングのためのものであるが、特定の発達段階は特に重要である場合、代替メディア条件や顕微鏡の設定を選択することができます。
図2: 回路図は、実験的な作業の流れを描きました 。プロトコルで説明した3つの主要なステップが示されています。まず、胞子及び使用済み培地は、静止期培養物から調製されます。第二に、新鮮な胞子はマイクロ流体システム及びSにロードされていますベネズエラは、最適な成長温度を維持するために、インキュベーションチャンバーを完全に自動化された倒立顕微鏡を使用して発達ライフサイクル全体を通して結像されます。第三に、得られたタイムラプスシリーズを分析し、オープンソースソフトウェアフィジーを使用して処理されます。
ストレプトマイライフサイクルのタイムラプス顕微鏡は、過去に技術的に困難となっています。ここでは、発生プログラム( 図2)を介して進行を視覚化し、トレースを助けるために細胞極性マーカーDivIVAと細胞分裂タンパク質のFtsZに蛍光タンパク質融合を使用して完全なライフサイクルの生細胞イメージングを実行するための堅牢なプロトコルを提示します。
この方法の中心には、Sの栽培です(MYM-TEを過ごした)使用済み培地で一定の媒体灌流および通常の増殖培地(MYM-TE)の交換を可能にするマイクロ流体デバイスでベネズエラ 。栄養豊富な培地の連続供給は栄養growtを刺激するのに対し、培養条件の変化は、胞子形成を促進し、使用済み培地中の任意のまだ正体不明の細胞外シグナル( 例えば 、クオラムセンシングシグナル)などの井戸のような栄養ダウンシフトので記載されているプロトコルには重要ですほとんど胞子形成とH(データは示さず)。従って、この微小流体システムにおいて細胞を培養することは、多くの実験的な柔軟性を提供し、培養条件の変化に応答して、細菌増殖の変化の長期的モニタリングを可能にするため、アガロース上で細胞を培養することに優れています。マイクロ流体プレートは単一の使用のために設計されているが、細胞を接種されていない流路は、その後の実験に使用することができます。私たちは長い時間のために開かれてきたプレートにマニホールドを密封する問題を経験しているように私たちは、一週間以内に、マイクロ流体板のすべてのチャネルを使用することをお勧めします。
実験を設定する際に、我々は、生殖管が(データは示していない)出現する前に凍結グリセロールストック由来する胞子は、少なくとも6時間を要したのに対し、新たに調製された胞子が、フローチャンバーにロードされる二時間以内に発芽することを見出しました。発芽中のこの遅延は、実験の長さを拡張し、を妨害することができます機器の可用性と実験条件。発芽管の開発と成長のための十分な栄養素を提供するために、少なくとも3時間MYM-TEの灌流を用いた実験を開始することも重要です。実験は栄養成長を研究するために設計されている場合MYM-TEによる灌流は、最初の3時間を超えて拡張することができます。胞子は、出発物質の好ましい選択を提供するが、短い菌糸断片はまた、マイクロ流体板にロードすることができます。しかし、剪断された菌糸体を使用して、積載効率が低く重要であり、多くの場合、非胞子形成変異体を検査するときの制限を提示することができるいくつかのロードを実行する必要があります。かかわらず使用接種物の種類の、メディア拡散を妨害し、画像解析を複雑にすることができ、迅速な過密につながるとして、胞子または菌糸断片と培養室をオーバーロードしないことが重要です。
レポータータンパク質の建設を計画することが重要ですcarefuLLY ストレプトミセスにおける蛍光タイムラプスイメージングで使用するため。標的タンパク質と蛍光レポーターおよびN末端またはC末端融合の選択肢の間のリンカーの長さが重要になる場合があります。また、撮影頻度及び露光時間を含む最適な実験条件は、それぞれの蛍光タグ化タンパク質のために予め決定される必要がある。S.低レベルで発現される蛍光標識したタンパク質を撮影するときに問題となる可能性があり、緑/黄色のチャネルでベネズエラ菌糸展示自家蛍光。また、発芽初期栄養成長段階の間、S.、ということに留意すべきですベネズエラは、短波長光( 例えば 、CFPへのタンパク質融合物を使用する場合)に特に敏感です。
細菌の生細胞イメージングのためのイメージング技術と、蛍光レポーターシステムの継続的な進歩にもかかわらず、ソフトウェアパッケージのほとんど( 例えば MicrobeTracker、Schnitzelcデータセットのこれらの種類のその後の自動処理のためのells、CellProfiler)は多細胞のライフスタイル27-29と糸状菌由来画像の解析をサポートしていません。従って、 ストレプトマイセスおよび他の糸状菌からの撮像データの定量的なハイスループット分析のための適切なアルゴリズムを開発する必要があります。
要約すると、ここで説明する作業は、Sの計り知れない可能性を示していますなぜなら、液体中に胞子を形成する能力の属のための新しいモデル発達システムとして、 ベネズエラ 。マイクロ流体培養装置は、不慣れなユーザーのために使用するのは簡単です。これは、動的なタンパク質の局在化、偏成長、およびunigenomic胞子の鎖に多細胞菌糸体の形態学的分化を含むストレプトマイライフサイクル、中央細胞生物学的プロセスを研究するための優れたプラットフォームを提供します。また、この実験セットのuPはまた、ペプチドグリカン合成またはヨウ化プロピジウム及び4を監視するための蛍光D -アミノ酸'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールなどの培養条件を交互に必要とする開発中のイベント、または蛍光色素の使用を調査するために魅力的な出発点を提供します染色体組織30,31を可視化する(DAPI)。
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Grant Calder for technical assistance with the microscope, Matt Bush for comments on the protocol, and the John Innes Centre for purchase of the Zeiss widefield microscope. This work was funded by BBSRC grant BB/I002197/1 (to M.J.B), by BBSRC Institute Strategic Programme Grant BB/J004561/1 to the John Innes Centre, by Swedish Research Council grant 621-2010-4463 (to K.F.), and by a Leopoldina Postdoctoral Fellowship (to S.S.).
B04A CellAsic ONIX plate for bacteria cells | Merck-Millipore | B04A-03-5PK | Microfluidic culture plates |
CellAsic ONIX Microfluidic Perfusion System and ONIX FG (version 5.0.2) | Merck-Millipore | EV-262 | The latest ONIX vesion (July 2015) and instructions on how to use the programme can be found here: http://www.merckmillipore.com |
Axio Observer.Z1 Microscope | Zeiss | 431007-9902-000 | Fully automated and motorized inverted widefield microscope |
Incubator XL multi S1 with Temperature Module S1 and Heating unit XL S2 | Zeiss | 411857-9061-000 | Environmental chamber surrounding the microscope |
Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC objective | Zeiss | 420792-9800-000 | |
Ocra FLASH 4 V2 | Hamamatsu Photonics K.K. | C11440-22CU | |
Illuminator HXP 120V | Zeiss | 423013-9010-000 | |
FL Filter Set 46 HE YFP shift free | Zeiss | 489046-9901-000 | Fluorescent filter set, excitation 500/25 nm, emission 535/30 nm |
FL Filter Set 63 HE RFP shift free | Zeiss | 489063-0000-000 | Fluorescent filter set, excitation 572/25 nm, emission 629/30 nm |
Mounting frame K-M for multiwell plates | Zeiss | 000000-1272-644 | Stage holder for microfluidic plate |
ZEN pro 2012 | Zeiss | 410135-1002-120 | Microscope control software |
ZEN Module Time Lapse | Zeiss | 410136-1031-110 | Software module to set up time-lapse microscopy experiments |
ZEN Module Tiles/Positions | Zeiss | 410136-1025-110 | Software module to save specific stage positions (xzy) |
Fiji | open-source software package | http://fiji.sc/Fiji | Generation of time-lapse movies |
Maltose-Yeast Exctract-Malt Extract (MYM) 4 g Maltose 4 g Yeast extract 10 g Malt extract add 1 L H2O using 50 % tap water and 50 % reverse osmosis water and supplement with 200 ml of R2 trace element solution per 100 ml after autoclaving |
Sporulation medium used to culture S. venezuelae SV60 | ||
R2 Trace element solution (TE) 8 mg ZnCl2 40 mg FeCl3-6H2O 2 mg CuCl2-2H2O 2 mg MnCl2-4H2O 2 mg Na2B4O7-10H2O 2 mg (NH4)6Mo7O24-4H2O add 200 ml H2O Autoclave and store at 4 oC |
Add 0.002 volumes to MYM | ||
PBS (phosphate buffered saline) | Sigma | P4417-100TAB | Used to refill inlet wells of unused lanes in B04A plates in order to prepare plate for short-term storage. |
0.22 µm syringe filters | Satorius stedim | 16532-K | Preparation of spent MYM-TE |
SV60 | John Innes Centre strain collection | S. venezuelae strain expressing divIVA-mcherry and ftsZ-ypet |