A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Een nieuw dissectie en opnametechniek beschreven voor bewaking afferente afvuren opgewekt door mechanische verplaatsing van de haren in de muis oorschelp. De techniek is zeer kosteneffectief en eenvoudig uitgevoerd met materialen algemeen in de meeste laboratoria elektrofysiologie of gemakkelijk gekocht. De dissectie is eenvoudig en snel, met de mechanische verplaatsing geleverd door een generieke electroceramische wafer bestuurd door eigen software. Dezelfde software ook registreert en analyseert de electroneurogram output. De opname van de opgeroepen zenuwactiviteit is door middel van een commercieel differentiële versterker die is aangesloten bij brand gepolijst standaard glas micro-elektroden. Handige tips worden gegeven voor het verbeteren van de kwaliteit van de voorbereiding, het stimuleren en de opnamecondities om de opname kwaliteit te optimaliseren. Het systeem is geschikt voor het testen van de elektrofysiologische en optische eigenschappen van lancetvormige terminals palissade uitgangen van haarzakjes, alsmede deresultaten van de farmacologische en / of genetische manipulatie. Een voorbeeld van het combineren zoals elektrische metingen met mechanische stimulatie en labeling met een styryl pyridinium vitale kleurstof wordt gegeven.
De lancetvormige terminals van sensorische axonen innerveren haarfollikels bij zoogdieren vormen palissaden rond het haar as epitheel. Hun doel is de mechanische verplaatsing van de haren ze omringen detecteren. Ze zijn een mix van snel en langzaam aan te passen eindes die voornamelijk produceren korte uitbarstingen van activiteit in reactie op haar beweging. Activiteit beëindigt zeer snel wanneer beweging stopt, zelfs in aanwezigheid van voortdurende verplaatsing. Hier beschrijven we de ontwikkeling van de oorschelp murine model voor studies lieten structuur en functie in lancetvormige terminals. De oorschelp heeft veel voordelige kenmerken voor het bestuderen van deze uitgangen. Ten eerste, de oorschelp in wezen twee huidlagen apposed back-to-back, met weinig andere weefsel tussen verstoren toegang tot de follikels en terminals. De huid is dun en gemakkelijk ontleed door minimale hoeveelheden aan bindweefsel. De innervatie is gemakkelijk bereikbaar en herkenbaar. Terwijl haar follicles aanwezig, zij relatief dun verspreid, vergemakkelijkt het stimuleren van individuele of kleine groepen follikels mechanisch. De dunne onderliggende huidlaag geeft een goede toegankelijkheid van de zenuwuiteinden met farmacologische drugs en kleurstoffen. Dit maakt ze bijzonder geschikt voor imaging studies met behulp van fluorescentie microscopie. De beeldvorming kan ofwel in levende terminals of na fixatie en verdere histologische verwerking.
De reacties van mechanosensorische neuronen innerveren haarfollikels traditioneel onderzocht bij knaagdieren vibrissae 1,2 en, in mindere mate, in geïsoleerde huidpreparaten 3,4. Die hebben ons veel over de algemene beginselen van mechanosensorische fysiologie in de zenuwuiteinden rondom de haarschacht geleerd. De vibrissal voorbereiding maakt exquise controle over de beweging van een enkele haarfollikel. Het kan echter moeilijk zijn om de productie als gevolg van de complexiteit ontcijferen als vibrissalfollikels bevatten ten minste 8 verschillende types van anatomisch verschillende mechanosensorische einde 5 en het matchen van deze morfologische types aan specifieke elektrofysiologische reacties is nog steeds een kwestie van geschil. De muis huid / vena zenuw preparaat wordt meestal gebruikt in zijn onthaard staat aan te raken en pijn reacties te onderzoeken. De innervatie van haarfollikels in zo'n preparaat minder complex, maar de dichtheid van de haarzakjes, plus de aanwezigheid van drie verschillende types follikel (guard, Priem / auchene en zigzag haren) zodanig dichte nabijheid 6, betekent het bestuderen van de specifieke reacties van een enkele follikel of één soort afsluiting wordt weer een uitdaging. Bovendien is dit preparaat een complex dissectie. Tenslotte, zowel vibrissal huid en andere preparaten, is het moeilijk om de uitgangen betrokken terwijl de ex vivo preparaten nog in leven visualiseren. Aldus wordt weefsel snijden Zelfs bij een GFP tot expressie muizenlijnen. Alternatitief, het vereist verdere histologische / immunologische verwerking, zoals fixatie en / of antilichaam incubatie voor immunofluorescentie.
We hebben daarom de oorschelp voorbereiding en gebruikte het om elektrische opnames te maken van een beperkte populatie van haarfollikel afferentia en laten zien dat het membraan fietsen optreedt in deze lanceolate eindes, blijkt uit de opname van styryl pyridinium kleurstoffen. Tenslotte hebben we aangetoond dat de kleurstof niet interfereert met mechanische gevoeligheid wijst dit apparaat geen mechanotransductie kanalen blokkeren. De resultaten van eenvoudige stimulatie en analyseprotocollen geïllustreerd.
Hier hebben we een betrekkelijk eenvoudige bewerking die snel kan worden ontleed ontwikkeld en geringe dichtheid haarfollikel en maakt relatief selectieve mechanische stimulatie van een klein aantal haarzakjes. Het is gemakkelijk toegankelijk voor elektrofysiologische opnemen en live-cell fluorescerende beeldvorming, met inbegrip van de reacties op aanvraag bij de mechanisch gestimuleerde haarzakjes, dwz beeldvorming follikels met gedefinieerde elektrofysiologische reacties te visualiseren verven. Hoewel we niet hebben gedaan, dit systeem lijkt ook gemakkelijk vatbaar is voor sub-verdelen van de sensorische zenuwen voor de eenheid (één zintuiglijke axon) opname en het gebruik van gerichte GFP-expressie voor het visualiseren van sensorische terminal eindigt morfologie.
Wij hebben de bereiding oorhuid de kenmerken van de opname en afgifte van het fluorescente membraan styryl kleurstoffen pridinium 7 onderzoeken, een techniek oorspronkelijk ontwikkeld om gelokaliseerde Vesic bestuderenle membraan recycling in synaptische terminals 8. In synapsen wordt beeldvorming ook direct in combinatie met gelijktijdige registratie van elektrofysiologische respons op geïdentificeerde terminals 8,9. Het was in deze vroege studies die we voor het eerst kennis genomen van de kleurstoffen werden ook geïnternaliseerd door mechanosensorische eindes 10. Voor de sensorische neuronen in kweek en slakkenhuis haarcellen, veel van de kenmerken van pyridinium styryl kleurstoffen lijkt kleurstoffen die door de mechanosensorische kanalen, die zij dan geblokkeerd 11,12 betrekken. De kleurstoffen label vervolgens intracellulaire membranen, en deze etikettering is onomkeerbaar. In haarcellen die niet mechanisch gestimuleerd 13,14 en in volledig gedifferentieerde primaire sensorische zenuwuiteinden in situ, zoals Ia eindes in spierspoeltjes 15, en de uitgangen lancetvormige hier 7, styrylkleurstof kenmerken lijkt membraan endocytose geven, aangezien etikettering is omkeerbaar en niet de mechanosensorische res blokkerenponses 7,15,16. Terwijl sommige kleurstof internalisatie per kanaal doordringen in deze endings niet volledig kan worden uitgesloten, blijkt uit de voortdurende afvuren tijdens kleurstof incubatie en de omkeerbaarheid van de etikettering, dat de grote meerderheid van de etikettering in gedifferentieerde terminals in situ is door internalisering met recycling blaasje membraan. Daarom is deze eenvoudige techniek gemakkelijk voor gecombineerde elektrische en optische controle van verschillende mechanosensorische terminal functies ex vivo weefsels.
Zoals bij de meeste praktische technieken zullen reproduceerbaarheid herhaling en werkwijzen is. Enkele van de belangrijkste punten waard bijzondere aandacht zal nu worden beschreven. Hele dissectie en opnamesessie maximaliseren weefsel levensvatbaarheid en overleving door zowel de bereiding constant geperfundeerd met zoutoplossing volledig verzadigd met 95% O2 / 5% CO2. Zorg ervoor dat de haarzakjes worden tijdens dit proces niet verplaatst, which will zintuiglijke einde vuren te stimuleren. Ofwel een continue laminaire stroming perfusiesysteem of zorgvuldig bel gas via het orgaanbad met fijne buis op afstand van de bereiding of zorgvuldig verversen producten elke 20-30 min, waarbij het preparaat onder de zoutoplossing onder alle omstandigheden. Zuig opname elektroden worden gemaakt door het modificeren van scherpe electrode borosilicate pipetten normaal gebruikt voor intracellulaire opname. Ten eerste, voorzichtig afbreken van de scherpe punten met # 3 tang om de juiste binnendiameter aan de zenuwen en brand-polish fit door zeer korte (<1 sec) blootstelling aan bunsenbrander vlam te geven (zie 2.4 en 2.5). Om een goede signaal-ruisverhouding bij het opnemen te krijgen, is het essentieel dat de elektrische impedantie (weerstand) in deze twee elektroden zowel gemaximaliseerd en gelijke. Doe dit door aandacht te besteden aan de volgende in de twee elektroden. Voor de registratie-elektrode, zorgen voor de inwendige diameter is een goede pasvorm voor de zenuw, en de maximale lengte van de nerve wordt in de registratie-elektrode. Probeer het bindweefsel rond de zenuw te gebruiken om effectief af te dichten de elektrode tip. Alternatief, of daarnaast, trekken het dunne uiteinde van een geschikte grootte, verloopstuk van vetweefsel langs de zenuw. Steek dan de elektrode door het toepassen van sterke zuigkracht voor ~ 1 min met een 50 ml spuit bevestigd aan de slang. Voor een goed afgesloten tip, het toepassen van sterke zuigkracht gewoon versterken van de effectiviteit van de plug en zal niet tekenen in meer liquide of zenuw. Om schade aan de zenuwen te voorkomen, echter voor zorgen dat het bindweefsel is het opvangen van de zenuw van compressie op het omringende materiaal en EAM kraakbeen. De indifferente elektrode moet de weerstand / impedantie van de registratie-elektrode zo dicht nabootsen mogelijk. Dit wordt geholpen door het zorgvuldig brand-polijsten van de tip om zo klein een opening mogelijk zonder daadwerkelijk te dichten. Als de verdere weerstand nodig is, dan sluit het einde van de onverschillige elektrode met Adipose bindweefsel, zoals hierboven voor de registratie-elektrode beschreven.
De electroceramische geeft exquise controle over de mechanische verplaatsing, zowel ruimtelijk als in de tijd. Echter, zorgen voor het maken van elektrische verbindingen – hoge temperaturen te vernietigen, dus geen gebruik maken van warm solderen. Gebruik-metal beladen epoxy lijm, of gebruik een specialist push-fit aansluiting aanbevolen door de leverancier. Dit zal zowel houd het stevig vast en stellen elektrische verbindingen. Bevestig het glas stimulerende sonde naar de electroceramische met standaard epoxyhars. Brand-polish na een standaard 10 cm x 1,5 mm diameter borosilicaatglas capillaire buizen gebruikt voor het maken patch of scherpe elektroden voor elektrofysiologische opname om het risico van weefselbeschadiging te minimaliseren. Als één haarfollikel stimulatie nodig is, brand-polish de tip om een enkele haar passen, en de positie van de sonde met een enkele haren in de open diafragma. Dit geeft exquise controle over een enkele haar. Voor styryl dye labeling is algemeen uniform weefsels jongere dieren. Het is niet geheel duidelijk waarom, maar dit weerspiegelt waarschijnlijk minder mechanische trauma en effectievere deep tissue verwijdering van de jongere weefsels. Wees grondig in het verwijderen van de schuimende laag gelijkende geëxpandeerd polystyreen bovenop de haarfollikel bases. Vermijd echter al te krachtig, omdat dit risico het verwijderen van de zenuw plexus laag en bijbehorende lancetvormig terminals. Als er weinig of geen elektrische responsie op haarfollikel beweging en styrylkleurstof toepassing leidt tot overheersende kenmerken van talgklieren (geel / wit) met verschillende autofluorescentie van de basis van de haarschacht plaats lancetvormige eindes (oranje / geel), over-enthousiaste goedkeuring heeft schade toegebracht aan de onderliggende weefsels. Bovendien zullen, met een kleurstof-cheleringsmiddel voor de beeldvorming sterk verbetert het contrast en de kwaliteit van het uiteindelijke beeld.
Deze techniek kan bruikbaar zijn bij een reeks verdere studies. deze could omvatten bijvoorbeeld screening op de mechanosensorische (s) die verantwoordelijk zijn voor rek opgewekte responsen door incuberen het preparaat met farmacologische liganden selectief voor kandidaat kanalen of screening muizenlijnen met dergelijke kanalen genetisch geschrapt. Deze laatste kan worden gecombineerd met fluorescentie beoordeling van eventuele veranderingen in terminal morfologie te wijten aan genetische manipulatie in de muis lijnen, bijvoorbeeld met NPY2R gekoppelde GFP expressie 17. Een laatste voorbeeld kan onderzoek naar de rol van synaptische-achtige blaasjes (SLV) 7 in deze lancetvormige terminals door het onderzoeken van het effect van modulatoren omzet SLV (Ca, Mg, alfa-latrotoxine, glutamaat receptor liganden) op het rek opgewekte reacties en styryl kleurstofopname / release. Dus, deze nieuwe techniek opent een reeks van potentieel interessante mogelijkheden van het onderzoek in mechansensory neurowetenschappen.
The authors have nothing to disclose.
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |