Summary

Селективный Заготовка Marginating-легочными Лейкоциты

Published: March 11, 2016
doi:

Summary

Marginating-pulmonary leukocytes exhibit unique characteristics and distinct immunological functions compared to other leukocyte populations. Here we describe selective harvesting of this subpopulation of pulmonary leukocytes, by forced perfusion of the lungs in rats and mice. Marginating-pulmonary leukocytes seem critical in determining susceptibility to blood-borne and lung-related diseases.

Abstract

Marginating-pulmonary (MP) leukocytes are leukocytes that adhere to the inner endothelium of the lung capillaries. MP-leukocytes were shown to exhibit unique composition and characteristics compared to leukocytes of other immune compartments. Evidence suggests higher cytotoxicity of natural killer cells, and a distinct pro- and anti-inflammatory profile of the MP-leukocyte population compared to circulating or splenic immunocytes. The method presented herein enables selective harvesting of MP-leukocytes by forced perfusion of the lungs in either mice or rats. In contrast to other methods used to extract lung-leukocytes, such as tissue grinding and biological degradation, this method exclusively yields leukocytes from the lung capillaries, uncontaminated with parenchymal, interstitial, and broncho-alveolar cells. In addition, the perfusion technique better preserves the integrity and the physiological milieu of MP-leukocytes, without inducing physiological responses due to tissue processing. This unique MP leukocyte population is strategically located to identify and react towards abnormal circulating cells, as all circulating malignant cells and infected cells are detained while passing through the lung capillaries, physically interacting with endothelial cells and resident leukocytes,. Thus, selective harvesting of MP-leukocytes and their study under various conditions may advance our understanding of their biological and clinical significance, specifically with respect to controlling circulating aberrant cells and lung-related diseases.

Introduction

Лейкоциты , прилипшие к капиллярам легких (т.е. marginating-легочная (МП) лейкоциты) 1 было показано, проявляют отчетливую состав лейкоцитов и уникальной активностью по сравнению с лейкоцитами из других иммунных отсеков (например, циркуляционной, селезенку, костный мозг) 2- 4. Например, МР-лейкоциты проявляют более высокую природные клетки-киллеры (NK) клетки, цитотоксичность в отношении различных опухолевых клеток, по сравнению с циркулирующими и селезеночной NK-клеток, а также дифференцированы информационной РНК (мРНК уровней) и повышенной секрецией про- и противовоспалительных цитокинов. Состав клеток также отличается от циркулирующих лейкоцитов, как MP-лейкоциты имеют более высокое отношение врожденной / адаптивного иммунитета по сравнению с циркулирующими лейкоцитами (50% против 30%, соответственно). Цель метода, изложенного в настоящем документе, для того, чтобы селективного сбора урожая МП-лейкоциты, чтобы изучить эту важную и уникальную иммунную отделение (популяцией клеток) и elucIDATE влияние различных манипуляций (например, активация иммунной системы ) на этих специфических клеток.

Для того, чтобы понять значение этого уникального населения, важно отметить , что иммунная система может контролировать циркулирующих опухолевых клеток, микрометастазов и остаточной болезни с помощью функций в естественных условиях клеточного иммунитета (CMI). Эта способность проявляется , несмотря на провал прецедент иммунной системы для контроля первичной опухоли, и поддерживается в естественных условиях достаточно доказательств , у онкологических больных и животных моделях 5. Важно отметить, что эти результаты часто несовместимы с ин витро и исследований исключая виво, которые сообщают о том , что большинство аутогенные опухолевые клетки устойчивы к цитотоксичности путем циркулирующих лейкоцитов в образцах крови от человека и животных (измеряется цитотоксичность) 6,7. Это несоответствие может быть связано с наличием в естественных условиях различных популяций лейкоцитов, таких как AFOREМП вышеупомянутый лейкоцитарной населения, и в частности , ее субпопуляции активированных клеток NK 3. Действительно, сингенных опухолевые клетки (MADB106), которые были найдены , чтобы быть устойчивым к циркулирующим и селезеночной лейкоцитах, было показано , что лизировать клетками МП-NK 3,8. Таким образом, как утверждается, «NK-устойчивые" MADB106 клетки, которые метастазируют в легкие fischer344 (F344) крыс контролируются клетками MP-NK, но не за счет циркуляции или селезеночных клеток NK, которые обычно изучали с учетом их легкость доступа.

Очищенные и активные MP-лейкоциты недоступны через стандартные методы уборки лейкоцитов из легких, которые основаны на измельчении легочной ткани или биологической деградации 9. Наш подход имеет два основных преимущества по сравнению с подходами к обработке тканей. Во-первых, перфузия подход выборочно собирает MP-лейкоциты, отделяя их от других клеток, которые происходят из паренхимы легких, интерстициальная и бронхо-альвеолярной COMPARtments. Во-вторых, метод перфузии лучше сохраняет целостность и физиологическую среду МП-лейкоциты, в отличие от измельчения и биологической обработки подходов, которые повреждают клетки, изменяют их морфологию, и индуцируют выработку и выделение различных факторов, которые модулируют иммунную активность и, в частности подавляют NK цитотоксичность 10.

Легкие являются основным органом-мишенью для метастазирования рака и различных инфекционных заболеваний. Все циркулирующие злокачественные клетки и инфицированные клетки проходят через капилляры легких, где они должны деформироваться и взаимодействовать с капиллярных эндотелиальных клеток и лейкоцитов резидентов. В этих условиях, циркулирующие клетки могут быть легко мишенью резидентных MP-лейкоцитах. Таким образом, представляется биологически выгодно иметь активированные лейкоциты в этом иммунном отсеке, и важно, чтобы изучить этот уникальный MP-население в различных биологических, экспериментальных и клинических условиях. Стоит отметить, что SYstemic активация иммунной системы с помощью различных биологических-реакция модификаторов (например, полиинозиновая-полицитидиловая кислоты (поли I: С) или С-типа CpG олигодезоксинуклеотиды (CPG-С ODN)) было показано , чтобы активировать MP-лейкоциты более циркулирующих лейкоцитах 3, 8,11.

Protocol

Процедуры с участием субъектов животных были одобрены по уходу и использованию комитета Institutional Animal (IACUC) в Тель-Авивском университете по. 1. Крыса протокола Препараты Устройте 2 бабочки 21 G иглы. Необязательно готовить 2 с тупыми краями бабочка 21 G иглы путем подачи острый к…

Representative Results

MP-купе обладают различной лейкоцитарной подмножеством состав по сравнению с циркулирующим лейкоциты. С помощью проточной цитометрии анализа субпопуляций лейкоцитов были идентифицированы и количественно охарактеризовать состав и циркулирующих и лейкоцитах МП. Гра…

Discussion

Метод, представленный здесь, позволяет выборочный сбор урожая и изучение уникальной популяции МП-лейкоцитами. По сравнению с циркулирующим или селезеночной лейкоцитах, население МП характеризуется отчетливым составом субпопуляций лейкоцитов, более высокие уровни активации, более в?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы и эта работа была поддержана NIH / NCI грант № R01CA172138 (для SBE).

Materials

Autoclud Peristaltic pump
Butterfly needle OMG 26G
Butterfly needle OMG 21G*3/4"
Syringe Pic solution 1 ml
Syringe Pic solution 2.5 ml
Syringe Pic solution 5 ml
Syringe Pic solution 10 ml
Syringe Pic solution 25 ml
Blunted-edged forceps
Scissors
hemostat
Tissue forceps
Heparin sodium porcine mucosa (perservative free) Sigma Aldrich

References

  1. Kuebler, W. M., Goetz, A. E. The marginated pool. Eur Surg Res. 34, 92-100 (2002).
  2. Benish, M., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in mice exhibits increased NK cytotoxicity and unique cellular characteristics. Immunol Res. 58, 28-39 (2014).
  3. Melamed, R., et al. The marginating-pulmonary immune compartment in rats: characteristics of continuous inflammation and activated NK cells. J Immunother. 33, 16-29 (2010).
  4. Shakhar, G., et al. Amelioration of operation-induced suppression of marginating pulmonary NK activity using poly IC: a potential approach to reduce postoperative metastasis. Ann Surg Oncol. 14, 841-852 (2007).
  5. Smyth, M. J., Godfrey, D. I., Trapani, J. A. A fresh look at tumor immunosurveillance and immunotherapy. Nat Immunol. 2, 293-299 (2001).
  6. Talmadge, J. E., Meyers, K. M., Prieur, D. J., Starkey, J. R. Role of NK cells in tumour growth and metastasis in beige mice. Nature. 284, 622-624 (1980).
  7. Grimm, E. A., Mazumder, A., Zhang, H. Z., Rosenberg, S. A. Lymphokine-activated killer cell phenomenon. Lysis of natural killer-resistant fresh solid tumor cells by interleukin 2-activated autologous human peripheral blood lymphocytes. J Exp Med. 155, 1823-1841 (1982).
  8. Melamed, R., et al. Marginating pulmonary-NK activity and resistance to experimental tumor metastasis: suppression by surgery and the prophylactic use of a beta-adrenergic antagonist and a prostaglandin synthesis inhibitor. Brain Behav Immun. 19, 114-126 (2005).
  9. O’Dea, K. P., et al. Lung-marginated monocytes modulate pulmonary microvascular injury during early endotoxemia. Am J Respir Crit Care Med. 172, 1119-1127 (2005).
  10. Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, A unique role for marginating-pulmonary and marginating-hepatic NK cells in cancer anti-metastatic surveillance and in immunotherapy. , (2014).
  11. Levi, B., et al. Continuous stress disrupts immunostimulatory effects of IL-12). Brain Behav Immun. 25, 727-735 (2011).

Play Video

Cite This Article
Shaashua, L., Sorski, L., Melamed, R., Ben-Eliyahu, S. Selective Harvesting of Marginating-pulmonary Leukocytes. J. Vis. Exp. (109), e53849, doi:10.3791/53849 (2016).

View Video