Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.
Influenza A virus (IAV) hemagglutinine herkennen siaalzuren op het celoppervlak als functionele receptoren invoer in cellen te krijgen. Wilde watervogels zijn de natuurlijke reservoir voor IAV, maar IAV kan de soort barrière voor pluimvee, varkens, paarden en mensen te steken. Aviaire virussen herkennen siaalzuur door een α2-3 koppeling (aviaire-type receptoren) om een voorlaatste galactose bevestigd terwijl menselijke virussen bij voorkeur siaalzuur met een α2-6 koppeling (human-type-receptoren) te herkennen. Om te controleren of aviaire virussen zich aanpassen aan de menselijke soort receptoren, kan op verschillende manieren worden gebruikt. Glycan microarrays met diverse bibliotheken van synthetische sialosides worden steeds meer gebruikt om receptorspecificiteit te evalueren. Echter is deze techniek niet gebruikt voor het meten aviditeiten. Meting van de aviditeit wordt gewoonlijk bereikt door het evalueren van de binding van serieel verdunde virus hemagglutinine of glycanen geadsorbeerd conventionele polypropyleen 96-well platen. In deze assay glycanen met α2-3 of α2-6 siaalzuren gekoppeld aan biotine en streptavidine geadsorbeerd aan platen of gekoppeld zijn met polyacrylamide (PAA) die direct adsorberen aan de kunststof. We hebben aanzienlijk verkleind deze test door direct printen-PAA verbonden sialosides en hun niet-PAA gebonden tegenhangers micro-putjes objectglaasjes. Deze set-up, met 48 arrays op een enkele dia, maakt gelijktijdige analyses van 6 glycan bindende eiwitten op 8 verdunningen, ondervragen 6 verschillende glycanen, waaronder twee niet-gesialyleerde controles. Dit is gelijk aan 18x 96-well platen in de traditionele assay plaat. De glycan array-formaat vermindert consumptie van verbindingen en biologische en dus verbetert de efficiëntie.
Wilde vogels zijn de natuurlijke reservoir voor iav, maar IAV kan de soort barrière voor gevogelte en zoogdieren, waaronder de mens. Avian IAVS herkennen α2-3 gekoppelde siaalzuren (aviaire-type receptoren), terwijl menselijke virussen binden α2-6 gekoppelde siaalzuren (human-type-receptoren). In staat zijn om efficiënt te repliceren en te verzenden tussen mensen een aviaire IAV moet binden aan menselijke-type receptoren 1.
IAVS verdeeld gebaseerd op serologische dat de antigeniciteit van het hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) envelopglycoproteïnen karakteriseert. HA bindt aan siaalzuren, terwijl de NA-receptorvernietigend enzym aan het andere uiteinde van de virale levenscyclus en splijt siaalzuur 2. Alle menselijke infecterende virussen, waaronder H1N1, H2N2 en H3N2, hebben een aviaire oorsprong 3. In de afgelopen twee decennia een aantal vogels aan menselijke crossovers hebben voorgedaan, met H5N1, H7N7 en H7N9 zijnde de meest bekende; however, hebben andere subtypen meer sporadisch besmette mensen (H6N1, H7N1, H7N2, H9N2, H10N7, H10N8) 4. Gelukkig lijkt het erop dat geen van deze virussen volledig kunnen aanpassen aan humane type-α2-6 gekoppeld siaalzuur receptoren 5-8 zijn. Aanpassing van aviaire of andere zoönotische virussen replicatie en transmissie in menselijke gastheren tegemoet kan een verwoestende uitwerking op de menselijke gezondheid. Daarom voorafgaande kennis van hoe deze virussen evolueren tot mens-type receptoren binden zal wereldwijd de bewaking van opduikende influenzavirussen helpen.
Bepaling van de receptor voorkeur werd voor het eerst opgehelderd met behulp van erytrocyten van verschillende soorten en blijft een favoriete test onder griep onderzoekers 9-12. De demonstratie dat vogelvirussen herkennen α2-3 siaalzuur en menselijke virussen α2-6 gekoppeld siaalzuur werd oorspronkelijk gebaseerd op een analyse met gebruik hemagglutinatie van erytrocyten enzymatisch ontworpen om elk van de li bevattennkages 13,14. Hoewel de uitlezing hemagglutinatie, een standaard test voor virologen, zijn de onderliggende glycan structuren niet bepaald, alleen de terminal koppeling. Bovendien, de beperkte beschikbaarheid van de sialyltransferasen, die opnieuw sialylate de cellen is het gebruik van deze test 15-18 beperkt. Vervolgens, indien andere methoden voor-receptor-bindende voorkeuren werden geïntroduceerd met behulp van gesialyleerde glycan structuren gekoppeld aan poly-acrylamide (PAA) of poly-glutamaat (PGA) structuren in-plaat gebaseerde testen 19,20. Verscheidene variaties zijn mogelijk in het bekleden hetzij de glycanen of virussen microtiterplaten, die elk resulteert in een robuuste, betrouwbare en gevoelige ELISA-type assay 21-23. Als alternatief kan biotine-gekoppelde glycanen vervangen PAA / PGA en kan worden geconjugeerd aan streptavidine-beklede platen 2,24. Hoewel een aantal specifieke sera kan worden verlangd, ELISA's zijn standaard en verschillende glycanen gekoppeld aan PAA worden gemakkelijk commercially en niet-commercieel verkrijgbaar (Consortium voor Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org)).
Glycan microarray technologie naar voren zijn gekomen als een waardevol instrument om receptor specificiteit te bepalen, als meerdere verschillende glycanen worden gespot, en de binding aan een breed scala van verschillende structuren kan binnen één assay 25-29 worden beoordeeld. De binding van IAV deze structuren een beter begrip van de glycan structuren die IAV herkent bij voorkeur 30-33. Glycan microarrays vereisen kleine hoeveelheden van het monster volume tot een bindende analyse uit te voeren en gebruikt slechts minieme hoeveelheden van glycan per spot (2 nl). Echter, deze arrays typisch alleen gebruikt om de specificiteit van glycanen receptoren geëvalueerd. Analyse van meerdere virussen of hemagglutinine proteïnen, op meerdere concentratiebereik kan worden onbetaalbaar door het aantal dia's vereist. Bovendien tot op heden geen relatieve aviditeit assay is ontwikkeld volgens glycan array-technieken.
De lage vereiste monster verschaft door glycan microarray technieken en de gevoeligheid van PAA gekoppelde glycanen in ELISA-gebaseerde testen te combineren, zochten wij een multiwell-glycan array die zou zorgen voor een hoge-doorvoer analyse met gelijke of betere -oplossing vergeleken de traditionele ELISA gebaseerde bepaling. Tegelijkertijd wilden we het bedrag van biologicals en reporter chemicaliën verbruikt een minimum te beperken. Het uiteindelijke resultaat is een geminiaturiseerde aviditeit test specifiek ontwikkeld om toezicht IAV specificiteit en is eveneens toepasbaar op andere glycan bindende eiwitten bepalen. Gebruik een glasplaatje gescheiden in 48 microputjes door een Teflon masker, worden 6 verschillende glycanen gespot in 6 replicaten per putje. De microarray platform biedt dezelfde trends in receptorbinding gezien in de macro ELISA formaat met een aantal voordelen. Deze omvatten (I) drukken van verbinding 6 replicaten, met minimale monster versus het bekleden van meerdere rijen ina plaat, met behulp van 100 pl per putje; (II) meerdere verschillende verbindingen geanalyseerd gelijktijdig in één goed, met inbegrip van controles; (III) een enorme afname incubatievolume en; (IV) een groter dynamisch bereik met een fluorescente uitlezing. Eén dia kan worden berekend gelijk aan 18x 96-well platen zijn.
Het volgende protocol, elk laboratorium kunnen fabriceren en analyseren bevlekte microarrays moeten kunnen deze geminiaturiseerde ELISA format vervaardigen.
Het beoordelen van IAV receptor specificiteit is een belangrijke stap in het analyseren van mogelijke pandemie van aviaire virussen. Siaalzuur erkenning door het virus is gekoppeld aan verschillende biologische eigenschappen zoals binding aan en afgifte uit de cel. Kennis van die aminozuur mutaties nodig zijn voor aviaire virussen te bereiken α2-6 binding en steek de soort barrière maakt pandemie. Verschillende assays worden toegepast om receptor specificiteit te bepalen; echter allemaal hun nadelen, met alleen meten …
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Scripps Microarray Core Facility, en een contract van de Centers for Disease Control (JCP). RPdV is een ontvanger van een Rubicon en VENI-subsidie van de Nederland Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO). Het Consortium voor Functional Glycomics (http://www.functionalglycomics.org/) gefinancierd door NIGMS subsidie GM62116 (JCP) die verschillende glycanen gebruikt in deze studie. Dit is publicatie 29113 van het Scripps Research Institute.
NEXTERION® Slide H MPX-48 | Schott | 1091525 | Microwell slides |
ProScanArray Plus | PerkinElmer | discontinued | confocal microarray scanner |
Innoscan 1100AL Scanner/Mapix Software | Innopsys | – | confocal microarray scanner |
MicroGrid II | Digilab | – | microaray printer |
SNA | Vector Labs | B-1305 | Plant Lectin |
ECA | Vector Labs | B-1145 | Plant Lectin |
Anti-Strep Antibody | IBA | 2-1509-001 | Anitbody for HA binding |
Anti-Mouse Alexa-647 | Life | A-21235 | Anitbody for HA binding |
Tween-20 | Sigma | P2287 | detergent |
di-basic Sodium Phosphate | Sigma | 255793 | printing buffer component |
mono-basic Sodium phosphate | Sigma | 229903 | printing buffer component |
poly-l-lysine solution | Sigma | P8920 | pre-spotting slide component |
sodium hydroxide | Sigma | 221465 | pre-spotting slide component |
ethanol | Sigma | 493546 | pre-spotting slide component |
phosphate buffered saline | Corning | 46-013-CM | incubation/washing buffer |
SMP4B pins | Telechem | SMP4B | printing pin |
Compressed Nitrogen (Grade5) | Praxair | UN1066 | general dusting/drying tool |
Boric Acid | Sigma | B6768-500G | Slide blocking reagent |
ethanolamine | Sigma | E9508-500ML | Slide blocking reagent |
Atto 488 | AttoTec | AD 488-91 | Gridmarker on array |
PAA-LNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA368 | Spotted glycans |
PAA-3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA362 | Spotted glycans |
PAA-6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | PA343 | Spotted glycans |
LNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te98 | Spotted glycans |
3SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te175 | Spotted glycans |
6SLNLN | Consortium for Functional Glycomics | Te176 | Spotted glycans |
384-well microtiter plate | Matrix TechCorp | 4361 | Printing plate |
VWR lab marker | VWR | 52877-150 | Slide Numbering |
Wheaton slide staining dish | Sigma | Z103969-1EA | Blocking and Drying |