We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.
תערוכת Retroviruses העדפות אינטגרצית חתימה על המאזניים המקומיים ועולמיים כאחד. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט (1) דור של ספריות מגוונות של אתרי אינטגרציה retroviral באמצעות בתיווך קשירת PCR (LM-PCR) הגברת רצף של הדור הבא (NGS), (2) מיפוי המיקום הגנומי של כל virus- לארח צומת באמצעות BEDTools, ו (3) ניתוח הנתונים עבור הרלוונטיות סטטיסטיות. הדנ"א הגנומי מופק בתאים נגועים מפוצל על ידי עיכול עם אנזימי הגבלה או על ידי sonication. לאחר תיקון סוף DNA המתאים, linkers פעמים התקועות הוא ligated על DNA מסתיים, חצי מקונני PCR מתבצעת באמצעות פריימרים משלימים הוא חוזר מסוף הארוך (LTR) בסופו של הנגיף לבין DNA מקשר ligated. פריימרים PCR לבצע רצפים הנדרשים אשכולות DNA במהלך NGS, השוללים את דרישת קשירת מתאם נפרדת. בקרת איכות (QC) נערכה על מנת להעריך התפלגות גודל שבר דנ"א ולהתאיםאה DNA התאגדות לפני NGS. קבצי פלט רצף מסוננים עבור LTR המכיל קורא, ואת הרצפים בהגדרת LTR והמקשר נחתכים משם. רצפים התא המארח גזוז ממופים הגנום התייחסות באמצעות בלאט ו מסוננים עבור זהות מינימלית 97% עד לנקודה ייחודית בגנום התייחסות. אתרי אינטגרציה ייחודיים בחן עבור נוקלאוטיד הסמוך (NT) ביחס רצף והפצה לתכונות גנומי שונות. שימוש בפרוטוקול זה, ספריות באתר אינטגרציה גבוהות של מורכבות ניתן לבנות הדנ"א הגנומי בשלושה ימים. הפרוטוקול כולו שמקיף זיהום ויראלי אקסוגני של תאים בתרבית רקמה ניתן לאנליזה האתר אינטגרציה ולכן יכול להתנהל כ שבוע עד שבועיים. היישומים אחרונים של טכנולוגיה זו נוגעים ניתוח אורך של אתרי אינטגרציה מחולים עם HIV.
שילוב של ה- DNA הנגיפי (vDNA) לתוך הגנום של התא הפונדקאי הוא צעד חיוני במחזור חי retroviral. אינטגרציה מושגת על ידי integrase אנזים ויראלי (IN), אשר מבצע שני תהליכים קטליטיים ברורים שיובילו להקמת provirus מוכנס ביציבות 1. לפי יחידות משנה להעסיק את הקצוות של vDNA ליניארי כי נוצר באמצעות שעתוק לאחור, להרכיב את intasome מהסדר הגבוה עם vDNA מסתיים מחוזקת ביחד בידי לפי multimer 2-4. לפי וחותך את 'הקצוות של vDNA במורד הזרם 5'-CA-3 משתנה' 3 רצפים תהליך המכונה 3'-עיבוד, בהותירה את הפסקה 3 'מסתיים עם קבוצות הידרוקסיל תגובתי בכל vDNA הסופית 5-8. Intasome מיובא לאחר מכן לתוך הגרעין במסגרת אסיפה גדולה של מארח חלבונים נגיפיים הידועים כמתחם preintegration (PIC) 9-11. לאחר המפגש עם המטרה תאית DNA (tDNA), לפי משתמשת vDNA 3'-הידרוקסיל Groעליות לדבוק העליון tDNA וקצובות תחתונות בצורה מדורגת ובמקביל מצטרף vDNA לקבוצות פוספט 'tDNA 5 בתהליך של גדיל העברה 12,13.
העדפות אינטגרציה באתר התערוכה Retroviruses על המאזניים המקומיים והעולמיים. מקומית, אתרי אינטגרצית קונסנסוס מורכבים רצפי tDNA palindromic נשמרים בחולשה כי ההיקף בערך מחמישה עשר נ"ב במורד זרם מאתרי כניסת vDNA 14,15. גלובלי, רטרווירוסים למקד הסברים ספציפיים הכרומטין 16. ישנם שבעה סוגים retroviral שונים – אלפא באמצעות אפסילון, lenti, ו spuma. Lentiviruses, הכולל HIV-1, לטובת השתלבות גופות הגנים לרנ"א 17, בעוד gammaretroviruses לשלב מועדף למתחמי תחילת תעתיק (TSSs) ואזורים משפרים פעילים 18-20. בניגוד חד, spumavirus מוטה חזק כלפי heterochromאזורי atic, כגון 21 תחומי גן-עני הקשורים-lamina. העדפות בסיס tDNA מקומיות הם חלק גדול מוכתב על ידי רשתות ספציפיות של אנשי קשר nucleoprotein שבין פנימי tDNA 13,22,23. עבור lentiviruses ו gammaretroviruses, ביחס אינטגרציה ל- ביאורים הגנומי הוא במידה רבה מוסדר על ידי אינטראקציות בין לפי וגורמים הסלולר מאותו מקור 24-27. שינוי הפרטים של רשת אינטראקציה IN-tDNA 13,22,23,28 ושיבוש או Re-engineering IN-מארח אינטראקציות גורם 25-27,29-32 מוכחות אסטרטגיות כדי להתמקד מחדש אינטגרציה במישור המקומי והעולמי, בהתאמה.
כוחה של נהלי רצפי DNA היה מקטלגי אתרי אינטגרצית retroviral בכדור הארץ גבר מאוד בעשורים האחרונים. אתרי אינטגרציה שנמצאו בעבודתו החלוצית באמצעות טיהור מייגעת וטכניקות שיבוט ידניות להניב רק קומץ של אתרים ייחודיים לכל 33,34 מחקר.השילוב של הגברת LM-PCR של צמתי DNA LTR-מארח עם היכולת למפות אתרי אינטגרצית פרט הגנום אנושי ועכבר טיוטה הפך את השדה, עם מספר האתרים התאוששו מזיהומי תרבית תאי אקסוגניים רקמות הגדיל לכמה מאה לאלפי 17 , 18. השילוב עדכנית יותר של LM-PCR עם מתודולוגיה NGS שלח נסיקת עומק הספרייה. באופן ספציפי, pyrosequencing הניב בסדר גודל של עשרות אלפי אתרים שילוב ייחודי 30,35-38, בעוד ספריות רצף באמצעות אשכולות DNA יכול להניב מיליוני רצפים ייחודיים 19-21,39. כאן אנו מתארים פרוטוקול LM-PCR אופטימיזציה עבור הגברה וסדר אתרי אינטגרציה retroviral באמצעות NGS אשכולות DNA. השיטה משלבת נדרשת רצפי מתאם לתוך פריימרים PCR ומכאן ישירות לתוך מולקולות דנ"א המוגברות, ובכך מניעת דרישת צעד קשירת מתאם נוסף לפני sequencing 40. צינור ניתוח bioinformatic, מן הניתוח של נתוני רצף גלם צומת DNA LTR-לארח את המיפוי של אתרי אינטגרציה ייחודיים רלוונטי תכונות גנומית, גם מתואר בדרך כלל. בהתאם עדיפות הוקמה מתוך פרוטוקולים מתודולוגיים לפני בתחום זה 36,38,41-43, סקריפטים מותאמים אישית ניתן לפתח על מנת לסייע בהשלמת צעדים ספציפיים בצנרת ביואינפורמטיקה. השירות והרגיש של הפרוטוקול מודגם עם נתונים נציג ידי הגברה, רצף, ומיפוי אתרי אינטגרציה HIV-1 מתאי בתרבית רקמה הנגוע על הריבוי המשוער של זיהום (משרד פנים) של 1.0, כמו גם סדרת טיטרציה של DNA זה מדולל באמצעות הדנ"א תאי נגוע ב 5-לקפל צעדים לדילול מקסימלית של 1: 15,625 להניב משרד הפנים המקבילים המשוער של 6.4 x 10 -5.
פרוטוקול לניתוח אתרי אינטגרציה retroviral, משלב הזיהום בנגיף הראשוני ועד מיפוי של דפוסי תפוצה גנומית, מתואר. פרוטוקול זה חל על כל רטרו-וירוס וכל סוג תא infectable. יתר על כן, צינור assay רגישה למדי, עם פוטנציאל להתאושש מספר משביע רצון של אתרי שילוב ייחודי בין דילולים סדרתי של שווה ?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים עמיתינו סטיבן יוז והנרי לוין לייעוץ היה קריטי להקים פרוטוקול NGS עבור סידור האתר אינטגרציה retroviral במעבדה אנגלמן. עבודה זו נתמכה על ידי ארצות הברית המכונים הלאומיים לבריאות מענקים AI039394 ו AI052014 (כדי Ane) ו AI060354 (מרכז אוניברסיטת הרווארד לחקר האיידס).
DMEM | Gibco | 11965-084 | Standard cell culture medium, compatible with HEK293T cells |
Fetal Bovine Serum | Thermo Scientific | SH 30088.03 | Different lots of serum may need to be pre-screened for optimal viral production |
Penicillin/Streptomycin | Corning | 30-002-Cl | Antibiotics to be added to DMEM |
Phosphate-buffered saline | Mediatech | 21-040-CV | Used to wash cells |
Trypsin EDTA | Corning | 25-053-CI | Used to detach adherent cells from tissue culture plates |
PolyJet | SignaGen Laboratories | SL100688 | DNA transfection reagent |
0.45 µm Filters | Thermo Scientific | 09-740-35B | Used to filter virus particle-containing cell culture media |
Turbo DNase | Ambion | AM2239 | Used to degrade carryover plasmid DNA from virus stocks |
HIV-1 p24 Antigen Capture Assay | ABL Inc. | 5447 | Used to quantify yield of virus production |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | Used to purify genomic DNA from cells |
Sonicator | Covaris | S2 | With this model of sonicator perform two rounds of duty cycle, 5%; intensity, 3; cycles per burst, 200; time, 80 sec |
Nuclease-Free Water | GeneMate | G-3250-125 | Commercially-available water is recommended to reduce the possibility of sample cross-contamination |
QIAQuick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | Used to purify DNA during library construction |
End-It DNA End-Repair Kit | Epicentre | ER81050 | Used to repair DNA ends of sonicated DNA samples |
Klenow Fragment (3'-5' exo–) | New England Biolabs (NEB) | M0212S | Used with dATP to A-tail repaired DNA fragments |
dATP | Thermo Scientific | R0141 | Deoxyadenosine triphosphate |
MseI | NEB | R0525L | Restriction endonuclease for genomic DNA cleavage |
BglII | NEB | R0144L | Restriction endonuclease to suppress amplification of upstream HIV-1 U5 sequence |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202L/6218 | Enzyme for covalent joining of compatible DNA ends |
DNA Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | custom | Have the company purify the oligos. HPLC purification suffices for DNAs <30 nucleotides; PAGE purify longer DNAs |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639202 | Commercial mix containing DNA polymerase for PCR |
dNTPs (100 mM solutions) | Thermo Scientific | R0181 | Dilute the four chemicals on ice with sterile water to reach the intermediate worrking concentrations of 2.5 mM each dNTP |
NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer for determination of DNA concentration |
Qubit Fluorimeter | Life Technologies | Qubit® 3.0 | Fluorometer used to confirm integration site library DNA concentration |
2200 TapeStation System | Agilent | G2964AA | Tape-based assay to confirm integration site library DNA size distribution |
MiSeq | Illumina | SY-410-1003 | Used for NGS |