We describe here a protocol for isolating myeloid cells from mouse skin and draining lymph node following intradermal injection of Plasmodium sporozoites. Flow cytometry of collected cells provides a reliable assay to characterize the skin and draining lymph node inflammatory response to the parasite.
Infecção da malária começa quando a fase de esporozoíto do Plasmodium é inoculada na pele de um mamífero hospedeiro através de uma picada de mosquito. O parasita altamente móveis não só atinge o fígado para invadir hepatócitos e se transformar em forma de eritrócitos-infeccioso. É também migra para a pele e para o nó de linfa de drenagem proximal do local de injecção, onde pode ser reconhecido e degradado por residente e / ou células mielóides recrutados. Imagens intravital informou o recrutamento precoce de leucócitos positivos brilhantemente fluorescente Lys-GFP na pele e as interações entre os esporozoítos e CD11c + células do linfonodo de drenagem. Nós apresentamos aqui um procedimento eficiente para recuperar, identificar e enumerar as subpopulações de células mielóides que são recrutados para a pele do rato e drenagem dos linfonodos após a injecção intradérmica de doses imunizantes de esporozoítos num modelo murino. Caracterização fenotípica utilizando fluxo multi-paramétrico fornece citometriaum ensaio fiável para avaliar alterações precoces celulares dinâmicas durante a resposta inflamatória à infecção por Plasmodium.
A malária é uma das mais mortais doenças infecciosas no mundo, matando mais de meio milhão de pessoas por ano. A infecção pelo Plasmodium, o agente causador da doença, começa por uma fase de pré-eritrocítico (PE). Durante esta fase, os esporozoitos injectados na pele hospedeiro por um mosquito fêmea Anofelíneos atingir o fígado através da corrente sanguínea e diferenciam hepatócitos no interior para as formas de parasitas que infectam as células vermelhas do sangue e causam os sintomas da doença.
Os estágios PE de Plasmodium representar um alvo privilegiado para a vacinação anti-malária. Na verdade, vacinas vivas atenuadas contra essas etapas, tais como radiação atenuada esporozoítos (RAS), parasitas geneticamente presos (GAP) ou quimioprofilaxia e esporozoítos (CPS) demonstraram a sua capacidade para proteger tanto de roedores e hospedeiros humanos 1-9. No modelo de roedores, a maioria dos estudos de vacinação são conduzidas utilizando imunização intravenosa, Que é o padrão ouro em termos de eficácia protetora. No entanto, a descrição de uma etapa da pele e a importância do linfonodo de drenagem associada à pele (DLN) na indução de protecção mudou nossa percepção da fase de PE e enfatizou a importância da via intradérmica da injeção. Imagiologia intravital de P. esporozoítos berghei injectados na pele de roedores tem mostrado que apenas ~ 25% do inoculo atinge o fígado através da corrente sanguínea. Os restantes 75% ~ distribui entre o DLN proximal (~ 15%) e a pele (~ 50%) 10,11, onde uma pequena parte pode transformar e permanecer vivo por semana no interior das células da pele 12,13. Além disso, estudos subsequentes descrito que o estabelecimento de imunidade protetora eficaz após a imunização intradérmica ocorre principalmente na pele ed-Din, onde as células T CD8 + específicas do parasita são ativadas, e apenas marginalmente no baço ou fígado-dLNs 14,15.
Enquantoa maioria dos estudos têm-se concentrado sobre a caracterização das células efectoras implicadas no estabelecimento da resposta imunitária protectora, muito menos se conhece sobre o destino de parasitas vivos atenuados injectados para dentro da pele, em especial as suas interacções com o sistema imune inato. Em particular, a caracterização das células apresentadoras de antigénios envolvidos na captação de antigénio parasita, processamento e apresentação a células T CD8 + é de importância crítica, sabendo que a aquisição antigénio PE pode ocorrer tanto na pele e compartimentos DLN. Estudos prévios de imagens intravital descrito um influxo precoce de células positivas brilhantemente fluorescentes Lys-GFP na pele após uma picada de mosquito infecciosa 16 enquanto primeiros interacções entre os esporozóitos e células dendríticas foram observados no DLN 10,17. Mais recentemente, foi relatado que os esporozoitos inoculados na pele por mosquitos aumenta a motilidade de ambas as células T reguladoras dendríticas e na pele deratinhos, enquanto que um número de diminuição de células apresentadoras de antigénio foi observada no DLN 18.
Nós teve como objetivo identificar e quantificar mais precisamente os subconjuntos de leucócitos recrutados na pele e DLN correspondentes, bem como aqueles interagindo com o parasita após a injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS 19. Neste contexto, foram isoladas células mielóides (CD45 + CD11b +) de ambos os tecidos e caracterizada subpopulações de interesse pelo multi = fluxo paramétrico citometria. Consistente com a resposta imune descrito no estádio precoce de parasita Leishmania major infecção da pele 20, a resposta do hospedeiro primário de esporozoíto de injecção consiste de um recrutamento sucessiva de neutrófilos polimorfonucleares (CD45 + CD11b + Ly6G + Ly6C int) seguido por monócitos inflamatórios (CD45 + CD11b + Ly6G – Ly6C +), que são identificadas com base na diferenciaramexpressão al dos marcadores de superfície Ly6G e Ly6C.
Descrevemos aqui um protocolo para isolar células mielóides a partir da pele do rato e DLN após injecção intradérmica de doses imunizantes de RAS extraídos de glândulas salivares do mosquito infectados. injecções intradérmicas reprodutíveis e processamento de tecidos são passos fundamentais para quantificar alterações fenotípicas de infiltração população de células nos tecidos infectados. A abordagem detalhado abaixo proporciona um ensaio fiável para avaliar a resposta inflamatória da pele e para DLN parasita Plasmodium e pode ser alargado a vários sistemas experimentais.
Na perspectiva de vacinação em larga escala de seres humanos usando uma vacina de esporozoíto da malária conjunto, um dos principais desafios para superar é desenvolver vias e métodos de administração parasita optimizadas para assegurar uma imunização bem sucedida e protecção 24,25. Nos seres humanos, a avaliação da eficácia protectora mediada por parasitas vivos atenuados (LAP) foi realizada seguindo natural mosquito morde 2, bem como intradérmica, subcutânea e 25,26 IV…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem Patricia Baldacci, Vanessa Lagal e Sabine Thiberge para a leitura crítica, Irina Dobrescu e Sabine Thiberge ajuda para tirar fotos e Pauline Formaglio para o ensino em imagem in vivo da motilidade esporozoítos na pele do rato. Nós também gostaríamos de agradecer Marek Szatanik e do Centro de Produção e Infecção do Anopheles (CEPIA-Institut Pasteur) para a criação do mosquito. Este estudo foi apoiado pelo Fundo AXA Pesquisa e fundos do Laboratoire d'Excellence "Biologia Integrativa de Doenças Infecciosas Emergentes" (conceder nenhuma. ANR-10-LabX-62-IBEID).
Ketamine: Imalgene® 1000 | Merial | – | – |
Xylazine: Rompun® 2% | Bayer | – | – |
NanoFil syringe + 35 gauge needle | World Precision Instruments | – | – |
Omnican® 50 Insulin syringe 0,5 ml/50 I.U. | B. Braun Medical | 9151125 | – |
MultiwellTM 6 well tissue culture plate – Flat Bottom | BD Falcon | 353046 | – |
70 µm cell strainer | BD Falcon | 352350 | – |
2 ml syringe | Terumo | SS-02S | – |
BLUE MAXTM 15ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | – |
BLUE MAXTM 50ml Polypropylene conical tube | BD Falcon | 352098 | – |
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with 35µm Cell-Strainer Cap | BD Falcon | 352235 | – |
DPBS 1X Cacl2- and MgCl2-free | Life Technologies | 14190-094 | – |
DMEM 1X + GlutaMAXTM | Life Technologies | 31966-021 | – |
Collagenase from Clostridium histolyticum, Type IV 0.5-5.0 FALGPA units/mg solid | Sigma-Aldrich | C5138 | 400 U/ml |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas, type IV | Sigma-Aldrich | D5025 | 50 µg/ml |
EDTA disodium salt | Sigma-Aldrich | E-5134 | 10mM or 2.5 mM |
FBS | Biowest | S1810-500 | – |
HEPES buffer solution (1M) | Gibco | 15630-056 | 25 mM |
Trypan blue Stain (0,4%) | Life Technologies | 15250-061 | Dilution 1:10 |
Anti-mouse CD16/CD32 (2.4G2 clone) | BD Biosciences | 553142 | 10µg/ml final (1:50) |
DAPI FluoroPureTM grade | Life Technologies | D21490 | 1µg/ml final |
Anti-mouse CD45 (30-F11 clone) | BD Biosciences | 559864 | Dilution 1:200 |
Anti-mouse CD11b (M1/70 clone) | BD Biosciences | 557657 | Dilution 1:400 |
Anti-mouse CD8α (5H10 clone) | Life Technologies | MCD0830 | Dilution 1:100 |
Female C57BL/6JRj mice (7-week-old) | Janvier Laboratories | – | – |