Here we report protocols to detect endogenous and exogenous centromere-kinetochore proteins in human cells and quantify these protein levels at centromeres-kinetochores by indirect immunofluorescent staining through the use of fixation (paraformaldehyde, acetone, or methanol fixation).
“Centromeres” and “kinetochores” refer to the site where chromosomes associate with the spindle during cell division. Direct visualization of centromere-kinetochore proteins during the cell cycle remains a fundamental tool in investigating the mechanism(s) of these proteins. Advanced imaging methods in fluorescence microscopy provide remarkable resolution of centromere-kinetochore components and allow direct observation of specific molecular components of the centromeres and kinetochores. In addition, methods of indirect immunofluorescent (IIF) staining using specific antibodies are crucial to these observations. However, despite numerous reports about IIF protocols, few discussed in detail problems of specific centromere-kinetochore proteins.1-4 Here we report optimized protocols to stain endogenous centromere-kinetochore proteins in human cells by using paraformaldehyde fixation and IIF staining. Furthermore, we report protocols to detect Flag-tagged exogenous CENP-A proteins in human cells subjected to acetone or methanol fixation. These methods are useful in detecting and quantifying endogenous centromere-kinetochore proteins and Flag-tagged CENP-A proteins, including those in human cells.
"Sentromerler" Klasik genetikte bastırılmış mayoz rekombinasyon bölgeleri olarak tanımlanan ve daha sonra mitoz sırasında doğru kromozom ayrımı önemli bir rol oynar mitotik kromozom birincil daralma olarak kabul edildi. "Kinetokorlar" elektron mikroskobu ile ortaya koyduğu gibi, sentromerlerinin yüzeyinde mikrotübül bağlanan katmanlı yapılar olarak tarif edildi; "Kinetokorlar" sonra mitotik kromozom sentromer de lokalize makromoleküler kompleksi olarak tanımlandı. omurgalılar arasında sentromerik DNA dizilerinin dramatik farklılığa rağmen, kinetochore yapısı ve bileşimi yüksek oranda korumalıdır. iğ mikrotübüller ve kinetokor oluşumunu uyarır arasındaki dinamik etkileşim mitoz sırasında kromozomların sadık ayrımı için gerekli olan ve sentromer-kinetochore fonksiyonu kurşun kusurları anöploidi ve böylece kanser olduğunu.
En ökaryotlarda sentromerResim tanımlanan DNA sekansına sahiptir, ancak 171-bp α-uydu DNA'dan oluşan tekrarlanan alphoid DNA'nın büyük diziler (0,3-5 Mb) oluşmaktadır. Maya tomurcuklanma dışında, sentromer kimliği olmayan DNA dizisi tarafından değil histon H3 varyantı CenH3 içeren özel bir nükleozom varlığı ile elde edilir (sentromer protein A [CENP-A] insanlarda). 5 CENP-A nükleozom lokalize 171-bp α-uydu DNA memeli kinetokorlar 7 ve bağlama iç plakası. Aktif sentromerler gerektiren CENP-A içeren bir araya mili kontrol noktasından mitotik iğ ve sonraki devir ilerlemesine kromozomların eki düzenleyen, bir kurucu sentromer ilişkili ağ (KİAN) ve kinetochore proteinlerin işe yönlendirmek için nükleozom.
Yukarıdaki deliller ışığında, CENP-A sentromer 8 epigenetik işareti olduğu ileri sürülmüştür; Bununla beraber, işlem hangi CENP-A i zikredilennBu sentromerik DNA, ve dahil edilmek için sorumlu olan faktörler henüz iyi karakterize edilmemiştir. Kısa bir sentromer hedefleme alanı (CATD) CENP-A bölgesini kat histon bulunur ve CATD ile H3 karşılık gelen bölgenin yerine sentromer doğrudan H3 için yeterlidir. 9 Çeşitli çalışmalarda post-translasyonel fonksiyonel rolleri önerilen modifikasyonu CENP-A 12-16 (PTM); Ancak, sentromer için istihdamında CENP-A bu PTMS moleküler mekanizmalar henüz ortaya konamamıştır. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligaz aktivitesi sentromer için CENP-A CENP-A K124 ubiquitylation ve lokalizasyonu için gerekli olduğu bildirilmektedir. 17
Kinetochore proteinlerin keşfi ve karakterize kromozom segregasyonu ile ilgili yeni bir bakış açısı yol açmıştır. 18 en fazla 100 kinetochore bileşenleri çeşitli yaklaşımlarla omurgalı hücreler tespit edilmiştir. 19,20 Altındafloresan mikroskopi kinetokorlar montaj ve işlevi de hücrelerin içinde her sentromer kinetochore proteinler ve protein-protein ağının hücresel fonksiyonları karakterizasyonu geliyor nasıl ayakta. 19 Doğrudan görselleştirme ve gelişmiş görüntüleme yöntemleri sentromer kinetochore bileşenlerin olağanüstü çözünürlük sağlar ve izin sentromerler ve kinetokorlar spesifik moleküler bileşenleri doğrudan gözlem. Buna ek olarak, özel antikorlar kullanılarak dolaylı immünofluoresan Yöntemi (IIF) boyama Bu gözlemler için çok önemlidir. Bununla birlikte, belirli bir sentromer kinetochore proteinlerin ayrıntılı problemlerinde tartışıldığı IIF protokolleri, birkaç ilgili olarak çok çeşitli raporlara rağmen. 1-4 Böylece geliştirilmesi ve spesifik olarak her bir sentromer kinetochore protein analiz IIF boyama ve kantitatif IIF tahlili yöntemleri rapor son derece önemlidir. IIF boyama, tek ilgilenilen proteinin kaybını önlemek için boyama protokolü ile devam etmelidir veyaHücrenin geri kalanı. Bununla birlikte, sabitleme zaman antigenik mahalleri yok eder ve farklı bir antikor-antijen kombinasyonları, bir fiksatif, yeterli çalışır, ancak çok iyi başka, 21 ve sabitleyici seçimi büyük ölçüde ilgi protein (ler) bağlıdır. Bu nedenle, farklı sabitleyici yöntemleri sentromer kinetochore proteinlerin IIF boyama önem taşımaktadır.
Dolaylı immunofloresans (IIF) boyama ve CENP-A ve Flag-künyeli eksojen CENP-A proteinleri ve insan hücrelerinde bu proteinlerin kantitatif dahil endojen sentromer kinetochore proteinlerin lokalizasyonunu gidermek için bir tahlilin Burada optimize yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler, diğer türlerde sentromer kinetochore proteinlerin analizi uygulanabilir.
Son yıllarda pek çok çalışma, sabit hücreler için farklı nicel mikroskopi deneyleri geliştirdik. 42 Progress sentromer kinetochore biyoloji genellikle hücre içi mekânsal-zamansal düzenleme değişen işlevlerini yansıtan hangi proteinlerin sentromer özgü veya kinetochore özel fonksiyon anlaşılmasını gerektirir hücre döngüsü sırasında bu proteinler. Bu nedenle, burada IIF boyama ve özellikle farklı tedavi örneklerde geçerli olabilir endojen ve eksojen CENP-A proteinlerinin nispi …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma NIH hibe GM68418 tarafından desteklenmiştir.
Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | transfection reagent I |
Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | transfection reagent II |
Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | Reduced serum media, warm in 37 °C water bath before use |
High-glucose DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | high-glucose DMEM, warm in 37 °C water bath before use |
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS (fetal bovine serum) |
Poly-L-Lysine SOLUTION | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water |
UltraPure Distilled Water | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | Sterile tissue culture grade water |
Micro Cover glass (22 mm x 22 mm) | Surgipath | 105 | Cover glass (22 mm x 22 mm) |
6 Well Cell Culture Cluster | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6-well polystyrene plate |
Penicillin, Streptomycin; Liquid | Fisher/Gibco | 15-140 | Penicillin-streptomycin |
PAP PEN | Binding Site | AD100.1 | Hydrophobic barrier pen (for a water repellant barrier in immunofluorescent staining) |
Paclitaxel (Taxol) | SIGMA-SLDRICH | T7402 | Taxol for mitotic cell analysis |
TN-16, microtubule inhibitor (TN16) | Enzo Life Sciences | BML-T120 | TN16 for mitotic cell analysis |
BSA (bovine serum albumin) | SIGMA-SLDRICH | A7906 | Blocking reagent |
Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | Detergent for permeabilization |
Paraformaldehyde | SIGMA-SLDRICH | P6148 | Fixation reagant |
DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | For nuclear staining |
p-phenylenediamine | SIGMA-SLDRICH | P6001 | For mounting medium |
VWR Micro Slides, Frosted | VWR International | 48312-013 | Micro slides |
Anti-CENP-A antibody | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CENP-B antibody | Novus Biologicals | H00001059-B01P | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-CENP-B antibody | abcam | ab25734 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF, methanol/acetone fixation)-1:400 (IIF, paraformaldehyde fixation) |
Anti-centromere antibody (ACA) | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | Human centromere antiserum; dilution ratio of 1:2000 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-H antibody | BD | 612142 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:200 (IIF) |
Anti-CENP-I antibody | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | N/A, Dr. Katusmi Kitagawa | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF); Niikura et al., Oncogene, 4133-4146 (2006) |
Anti-KNL1 antibody | Novus Biologicals | NBP1-89223 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Hec1 antibody | GeneTex | GTX110735 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Ska1 antibody | abcam | ab46826 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:100 (IIF) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F3165 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-Flag antibody | SIGMA-ALDRICH | F7425 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:1000 (IIF), 1:5000 (WB) |
Anti-CUL4A antibody | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | N/A, Dr. Pradip Raychaudhuri | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:3000 (WB); Shiyanov et al., The Journal of biological chemistry, 35309-35312 (1999) |
Anti-RBX1 antibody | Cell Signaling | 4397 | Rabbit polyclonal antibody; dilution ratio of 1:2000 (WB) |
Anti-GAPDH antibody | Chemicon | MAB374 | Mouse monoclonal antibody; dilution ratio of 1:5000 (WB) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody) |
Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk) | Fisher Scientific | NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629) | Skim milk |
Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope | Leica | motorized fluorescence microscope | |
HCX PL APO 63x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X oil immersion lens |
HCX PL APO 100x oil immersion lens | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X oil immersion lens |
Leica EL6000 compact light source | Leica | External compact light source for fluorescent excitation | |
ORCA-R2 Digital CCD camera | Hamamatsu | C10600-10B | digital CCD camera |
Openlab version 5.5.2 Scientific Imaging Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Velocity version 6.1.1 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer/Improvision | For image observation, acquisition, quantification, and analysis | |
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail | Roche | 11873580001/11836170001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
PlusOne 2-D Quant Kit | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 2% SDS) |
Bio-Rad Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Commercial protein assay reagent II for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS) |
Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | PVDF membrane for transferring |
IRDye 800CW Goat Anti-Mouse IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | IR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-Rabbit DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:20000 (IIF) |
Goat anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Goat anti-rabbit IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP-conjugated secondary antibodyDyLight-conjugated secondary antibodyIR fluorescent dye-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody); dilution ratio of 1:10000 (IIF) |
Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software | Improvision/PerkinElmer | Software A | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition) | PerkinElmer | Software B1 | |
Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification) | PerkinElmer | Software B2 | |
Branson SONIFIER 450 | Sonicator | ||
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | Disruptor horn for sonication |
Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | Microtip for sonication |
Odyssey CLx Infrared imaging System | LI-COR Biosciences | Infrared imaging system for immunoblot detection | |
Image Studio Analysis Software Ver 4.0 | LI-COR Biosciences | Software C | |
Molecular Imager Versadoc MP4000 System | Bio-Rad | Chemiluminescence imager for immunoblot detection | |
Quantity One 1-D analysis software | Bio-Rad | Software D | |
SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate | Thermo | 34095 | Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate |