في فيفو الدماغ أسلوب التصوير النهج القائم على الكالسيوم إضاءة الحيوية المؤشر GFP-aequorin
Summary
هنا نقدم الرواية كا 2+ -imaging النهج باستخدام مراسل إضاءة الحيوية. يستخدم هذا النهج تنصهر بناء GFP-aequorin الذي يربط الكالسيوم 2+ وتنبعث الضوء، مما يلغي الحاجة لالإثارة الخفيفة. كبير يسمح هذا الأسلوب التصوير المستمر الطويل، والوصول إلى هياكل الدماغ العميقة وقرار زمنية عالية.
Abstract
وظيفية في مجال التصوير فيفو أصبح نهجا قويا لدراسة وظيفة وعلم وظائف الأعضاء من خلايا المخ وهياكل الفائدة. في الآونة الأخيرة تم تطوير طريقة جديدة لكا 2+ -imaging باستخدام مراسل إضاءة الحيوية GFP-aequorin (GA). وتعتمد هذه التقنية الجديدة على التحام GFP وaequorin الجينات، مما ينتج عنه قادرة جزيء من الكالسيوم ملزمة و- مع إضافة coelenterazine العامل المساعد ل- انبعاث الضوء الساطع التي يمكن رصدها من خلال جمع الفوتون. تم إنشاء خطوط المعدلة وراثيا تحمل جينات GFP aequorin لكل من الفئران وذبابة الفاكهة. في ذبابة الفاكهة، فقد تم وضع الجينات GFP aequorin تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير GAL4 / UAS السماح للتعبير استهدافا والتصوير داخل الدماغ. وفيما بعد تبين أن هذه الطريقة لتكون قادرة على الكشف عن كل من الداخل كا 2+ -transients والكالسيوم 2+ -released من مخازن الداخلية. الأهم من ذلك أنها تتيح لمدة أكبر في تسجيل مستمر، والتصوير في أعماق أكبر في الدماغ، وتسجيلها في قرارات الزمنية عالية (تصل إلى 8.3 مللي ثانية). هنا نقدم الطريقة الأساسية لاستخدام التصوير إضاءة الحيوية لتسجيل وتحليل الكالسيوم 2+ -activity داخل الهيئات الفطر، هيكل مركزي في التعلم والذاكرة في الدماغ الطاير.
Introduction
وكانت الزخرفة وظيفة من النشاط في الدماغ وهياكلها الأساسية منفصلة فترة طويلة مجال الدراسة المكثفة في مجال علم الأعصاب. ربما بعض من أقرب النهج الناجحة المستخدمة لمعالجة هذه المسألة كان القياس الفسيولوجي المباشر للتغيير في النشاط الكهربائي – طرق لكن البديلة التي تسمح التصوير الحي للتغيرات في تركيز الجهد، ودرجة الحموضة أو الكالسيوم (كبديل للنشاط) قد جلبت قدرات إضافية ل دراسة نشاط الخلايا العصبية 1. تقنيات التصوير تحمل مجموعة واسعة من المزايا مثل انخفاض الغازية والقدرة على رصد النشاط داخل هياكل الدماغ كله. وعلاوة على ذلك في الحيوانات مع علم الوراثة الانقياد بما في ذلك ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة، وضع مؤشرات الكالسيوم المشفرة وراثيا، مثل CAMELEON، GCaMPs وغيرها 1 قد يسمح للباحثين لرصد الخلايا العصبية واحدة، السكان العصبية والدماغ كلهالهياكل. في حين أن أكثر أساليب التصوير الكالسيوم الفلورسنت التقليدية باستخدام GCaMPs (GFP تنصهر إلى كالمودولين) أو الحنق (CFP وYFP تنصهر كالمودولين) وقد ثبت أن تقنيات مفيدة توفير القرار المكانية والزمانية جيدة، وعملية الكامنة وراء الإثارة الخفيفة تولد بعض القيود على ه التجريبية التطبيقات. ونظرا لطبيعة الإثارة الخفيفة، تألق ذاتي، صور تبيض والضيائية تنتج حتما، مما يحد بالتالي عمق الهياكل التي يمكن تصويرها، ومدة التسجيلات فضلا عن الاستمرارية في الوقت الحقيقي من التسجيل. وبعبارة أخرى، يجب في كثير من الأحيان أن يؤديها التسجيلات بشكل متقطع لتجنب هذه الآثار الجانبية غير المرغوب فيها.
وبسبب هذه التحديات، وقد وضعت وسائل بديلة إضافية من التصوير الكالسيوم. إحدى الطرق الواعدة هو التصوير إضاءة الحيوية التي تعتمد على الضوء المنتجة من خلال رد فعل الأنزيمي بعد الكالسيوم ملزمة. Bioluminescenلا يتطلب تي التصوير الإثارة الخفيفة وبالتالي لا تواجه نفس الصعوبات التي والتصوير الكالسيوم التقليدية. مراسل إضاءة الحيوية Aequorin – معزولة عن Aequorea فيكتوريا، ونفس قنديل البحر الذي GFP كان isolated- أيضا يتحد الكالسيوم عن طريق الهياكل يدها ثلاثة EF ويخضع لتغيير متعلق بتكوين، مما يؤدي إلى أكسدة coelenterazine العامل المساعد والإفراج عن الضوء الأزرق (λ = 469 نانومتر) 2،3. Aequorin لها قابلية منخفضة جدا من الكالسيوم (K د = 10 ميكرومتر) مما يجعلها مثالية لمراقبة العابرين الكالسيوم لأنها تنتج الضوضاء في الخلفية قليلا جدا ولا تتداخل مع نظام التخزين المؤقت الكالسيوم داخل الخلايا 4. على الرغم من aequorin تم استخدامها سابقا لمراقبة عملية تحريض العصبي في البيض القيطم 5 ضوء المنتجة خافت جدا لاستخدامها في التصوير في الوقت الحقيقي من نشاط الخلايا العصبية. في محاولة للتصدي لهذا التحدي، فيليب تص &# 251؛ ولوزملاؤه في معهد باستور خلق بناء الوراثي التفجير GFP وaequorin الجينات، ومحاكاة للدولة الأم داخل قناديل البحر 4. هذا المنتج الانصهار الجين يرتبط الكالسيوم مرة أخرى عن طريق الهياكل جهة EF ثلاثة من aequorin، التي تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين يؤدي إلى أكسدة coelenterazine، الذي ينقل الطاقة غير إشعاعيا إلى GFP. هذه النتائج نقل الطاقة في الإفراج عن الضوء الأخضر (λ = 509 نانومتر) من GFP، بدلا من الضوء الأزرق من aequorin. اندماج GFP وaequorin أيضا يمنح قدر أكبر من الاستقرار البروتين يساعد على إنتاج ضوء انصهار بروتين 19-65 مرات أكثر إشراقا من aequorin وحده (4). باستخدام نهج إضاءة الحيوية داخل المخ يوسع تطبيق التجريبي الحالي من التصوير الكالسيوم سواء من حيث مدة التسجيل المتواصل وعدد من الهياكل في الدماغ التي يمكن تسجيلها. على نطاق واسع في سياق العمل السابق وهو ما يعني أن على الصعيدين العالمي وأكبريمكن رصد مجموعة متنوعة من إقليمي "النشاط" في الدماغ (من خلال وكيل العابرين الكالسيوم). الأهم من النشاط يمكن رصدها لفترة أطول، في الوقت الحقيقي، وبصورة مستمرة، وهو يفسح المجال بسهولة إلى السعي لتحقيق فهم كامل وظيفة القاعدية في الدماغ.
في السنوات القليلة الماضية، لدينا مختبر وغيرها قد وضعت الذباب المعدلة وراثيا معربا عن GFP-aequorin تحت سيطرة نظام ثنائي التعبير (GAL4 / UAS-GFP-aequorin) 5،6. وقد استخدمنا-GFP aequorin تلألؤ بيولوجي لتسجيل النشاط التي تنتجها المحفزات الطبيعية مثل رائحة 7،8، وكذلك دراسة المكونات الخلوية تحوير الكالسيوم 2+ -activity في الهيئات الفطر التالية مستقبلات الأستيل كولين التحفيز عن طريق تطبيق النيكوتينيك المباشر 9. بالإضافة إلى ذلك، فقد استخدمنا أيضا GFP-aequorin لمعالجة عدد من الأسئلة التجريبية التي لم تكن قادرة على معالجتها سابقا، مثل طويل الأجلالتصوير العابرين الكالسيوم عفوية والتصور من هياكل الدماغ أكثر عمقا 10. وفي الآونة الأخيرة، وقد استخدمنا النظام / UAS GAL4 للتعبير عن ATP مستقبلات الثدييات P2X 2 11 قناة الموجبة، في الخلايا العصبية الإسقاط (السندات الإذنية) واستخدام نظام LexA للتعبير عن GFP-aequorin في الهيئات الفطر (MB247-LexA، 13XLexAop2-IVS-G5A-BP) (مجاملة من B. فايفر، Janelia مزرعة، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد أتاح ذلك لنا لتفعيل السندات الإذنية من خلال تطبيق ATP، والذي بدوره ينشط الهيئات الفطر (هدف المصب من السندات الإذنية)، ومحاكاة أكثر الظروف الطبيعية، مثل استجابة لحافز الرائحة. عموما هذا الأسلوب يجمع بين P2X 2 و GFP-aequorin توسع الاحتمالات التجريبية. على نطاق واسع لأنه يتيح الفرصة لفهم أفضل لأنماط النشاط في المخ، وبدء دراسات جديدة حول كيفية المحفزات واضطرابات مختلفة يمكن أن يغير من الزخرفة القاعدية من النشاط.
Protocol
Representative Results
Discussion
نهج GFP aequorin القائم على إضاءة الحيوية التي وضعت مؤخرا المقدمة هنا يسمح في الجسم الحي تسجيل ظيفية من الكالسيوم 2+ -activity في الخلايا العصبية المختلفة، وكذلك إذا رغبت في ذلك، في نوع آخر من الخلايا مثل الخلايا النجمية الكلى كما ورد في كابريرو وآخرون. 2013 5.</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are indebted to E. Karplus, from Sciences Wares, USA, for his precious and useful help and advices. We thank E. Carbognin, A. Avet-Rochex, M. Murmu, P. Pavot, D. Minocci, G. Vinatier, and J. Stinnakre for their contribution to the development and improvement of this technique. We also thank B. Pfeiffer and G. Rubin, Janelia Farm, H.H.M.I., Ashburn, USA, for the pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP line. This work was supported by the Chateaubriand Fellowship, French Embassy, Washington, USA to A. Lark, by the National Science Foundation (IOS 1352882) to T. Kitamoto, and by the French ANRs (ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin, 2005, and FlyBrainImaging, 2011), the Conseil Régional Ile-De France (NeRF and DIM), the IFR-144, the Physique-Chimie-Biologie Interface Program of the CNRS (2009), and by the CNRS, France to JR Martin.
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCL | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate |
| benzyl-coelenterazine | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| dental glue | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp™ IV |
| silicon glue | 3M ESPE™ | 36958 | Express™ 2 Regular Body Quick |
| tape | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| pipette tips | Corning Incorporated | 4868 | 100-1000µL Univesal Pipette Tip |
| chamber and holder (stage) | N/A | N/A | hand made |
| incubation box | N/A | N/A | hand made |
| forceps (No 5) | Fine Science Tools | 11252-00 | Micro-dissecting forceps |
| curved forceps | Sigma-Aldrich | F4142 | Micro-dissecting forceps |
| glue applicator | N/A | N/A | hand made |
| knife | Fine Science Tools | 10316-14 | 5mm Depth 15° stab |
| EM-CCD camera | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon (cooled to -80°C) |
| Microscope | Nikon | N/A | Eclipse-E800 |
| immersion objective lens | Nikon | N/A | 20x Fluor .5w |
| dissection microscope with fluorescence | Leica MZ Fl III | N/A | leica dissection scope and florescent lamp |
| tight dark box | Science Wares | N/A | Custom built by Science Wares |
| peristaltic pump | Gilson | N/A | Minipuls 2 |
| tubing | Fisher Scientific | depends on thickness | Tygon R3603, St-Gobain |
| perfusion system | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | Perfusion valve control system, complete, with pinch valves, 6 channel |
| perfusion regulators | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| measurement and automation explorer | Sciences Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon imager | Science Wares & National Instruments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| photon viewer | Science Wares & National Instuments | N/A | software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | software https://www.microsoft.com |
| virtual dub | open access | N/A | software http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, Ref. 1 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn USA. | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima and Misenboeck, Ref. 11 | N/A | No stocks {currently} publicly available |
| OK107 | Bloomington stock center | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
References
- Martin, J. -. R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci USA. 75 (6), 2611-2615 (1978).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Further data on the bioluminescent protein, aequorin. J. Cell. Comp. Physiol. 62 (1), 1-8 (1963).
- Baubet, V., et al. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13), 7260-7265 (2000).
- Cabrero, P., Richmond, L., Nitabach, M., Davies, S. A., Dow, J. A. T. A biogenic amine and a neuropeptide act identically: tyramine signals through calcium in Drosophila tubule stellate cells. Proc. Biol. Sci. 280 (1757), 20122943 (2013).
- Leclerc, C., Webb, S. E., Daguzan, C., Moreau, M., Miller, A. L. Imaging patterns of calcium transients during neural induction in Xenopus laevis embryos. J. Cell Sci. 113 (19), 3519-3529 (2000).
- Martin, J. -. R., Rogers, K. L., Chagneau, C., Brûlet, P. In vivo bioluminescence imaging of Ca2+ signalling in the brain of Drosophila. PLoS One. 2 (3), e275 (2007).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Martin, J. -. R. Presynaptic Ca2+ stores contribute to odor-induced responses in Drosophila olfactory receptor neurons. J. Exp. Biol. 213 (24), 4163-4173 (2010).
- Murmu, M. S., Stinnakre, J., Réal, E., Martin, J. -. R. Calcium-stores mediate adaptation in axon terminals of Olfactory Receptor Neurons in Drosophila. BMC Neurosci. 12, 105 (2011).
- Pavot, P., Carbognin, E., Martin, J. -. R. PKA and cAMP/CNG channels independently regulate the cholinergic Ca2+-response of Drosophila mushroom body neurons. eNeuro. 2 (2), 0054-0068 (2015).
- Minocci, D., Carbognin, E., Murmu, M. S., Martin, J. -. R. In vivo functional calcium imaging of induced or spontaneous activity in the fly brain using a GFP-apoaequorin-based bioluminescent approach. BBA-Mol Cell Res. 1833 (7), 1632-1640 (2013).
- Lima, S. Q., Miesenböck, G. Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons. Cell. 121 (1), 141-152 (2005).
- Shimomura, O., Musicki, B., Kishi, Y., Inouye, S. Light-emitting properties of recombinant semisynthetic aequorins and recombinant fluorescein-conjugated aequorin for measuring cellular calcium. Cell Calcium. 14 (5), 373-378 (1993).
- Berridge, M. J., Bootman, M. D., Roderick, H. L. Calcium signalling: dynamics, homeostasis and remodelling. Nat Rev Mol Cell Bio. 4 (7), 517-529 (2003).
- Fiala, A., Spall, T. In vivo calcium imaging of brain activity in Drosophila by transgenic cameleon expression. Sci STKE. 2003 (174), PL6 (2003).
- Wang, J. W., Wong, A. M., Flores, J., Vosshall, L. B., Axel, R. Two-photon calcium imaging reveals an odor-evoked map of activity in the fly brain. Cell. 112 (2), 271-282 (2003).
- Wilson, R. I., Turner, G. C., Laurent, G. Transformation of Olfactory Representations in the Drosophila Antennal Lobe. Science. 303 (5656), 366-370 (2004).
