Quantifizierung von filamentösen Aktin (F-Aktin) Puncta in Rat Cortical Neurons
Summary
Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.
Abstract
Filamentösen Aktin-Protein (F-Actin) spielt eine wichtige Rolle in spinogenesis, synaptischer Plastizität und synaptischen Stabilität. Änderungen in dendritischen F-Actin-reichen Strukturen deuten darauf hin, Veränderungen der synaptischen Integrität und Konnektivität. Hier bieten wir Ihnen ein detailliertes Protokoll zur Kultivierung von primären Ratten-kortikalen Neuronen, Phalloidin-Färbung für F-Actin puncta und anschließende Quantifizierung Techniken. Zuerst werden die frontalen Kortex von E18-Rattenembryos dissoziiert in Low-Density-Zellkultur, dann die Nervenzellen in vitro gezüchtet mindestens 12-14 Tage. Folgenden experimentellen Behandlung werden die kortikalen Neuronen gefärbt mit AlexaFluor 488 Phalloidin (die dendritische F-Aktin puncta zu markieren) und Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2; die neuronalen Zellen und dendritischen Integrität zu validieren). Schließlich wird spezielle Software zu analysieren und zu quantifizieren zufällig ausgewählten neuronalen Dendriten verwendet. F-Actin reichen Strukturen sind auf zweiter Ordnung dendritischen Verzweigungen (Längenbereich 25-75 identifiziert &# 181; m) mit kontinuierlicher MAP2 Immunfluoreszenz. Das Protokoll hier vorgestellt wird eine nützliche Methode zur Untersuchung von Veränderungen in dendritische Synapse Strukturen im Anschluss an experimentellen Behandlungen.
Introduction
Das primäre Ziel dieser Studie ist es, eine zuverlässige Methode zur Messung (Schätzung) der synaptischen Integrität der neuronalen dendritischen Netzwerk zu entwickeln. Hier beschreiben wir die Quantifizierung von F-Actin puncta in primären Ratten kultivierten Neuronen eine Kombination von Phalloidin-Färbung verwendet und immunzytochemische (ICC) Erkennung von Dendriten mit anschließender Analyse mit speziellen (NIS-Elements) Software.
Markierten Phallotoxine haben ähnliche Affinität für sowohl große als auch kleine Filamente (F-Actin), aber binden nicht an monomeren globulären Actin (G-Actin), im Gegensatz zu einigen Aktin Antikörper 1. Die unspezifische Bindung von Phalloidin vernachlässigbar ist, so minimal Hintergrund während der zellulären Bildgebung bietet. Phalloidin ist viel kleiner als Antikörper, die normalerweise verwendet werden würde zelluläre Proteine für Fluoreszenzmikroskopie zu kennzeichnen, die durch Phalloidin für viel intensiver Markierung von F-Aktin ermöglicht. So detaillierte Bilder von F-Actin-Lokalisierung in Neuronen seindurch die Verwendung von markiertem Phalloidin erhalten.
Phalloidin (F-Actin) Färbung der neuronalen Dendriten erzeugt diskrete "Hot Spots" oder hell "puncta", die eine Vielzahl von dendritischen Strukturen darstellen, einschließlich reifen Stacheln, nicht stachelig Synapsen 2 und unreif Stacheln. Unreife Stacheln sind dünn Filopodien und einige Formen von Patch-Morphologie und kann die Einleitung spinogenesis 3 darstellen. Unreife Stacheln und nicht stachelig Patches fehlen PSD95 4. Veränderungen in der Produktion von F-Aktin führen zu Änderungen in nachfolgenden nicht nur Stacheln sondern auch zusätzliche dendritischen Strukturen, wodurch Phalloidin ein wichtiges Werkzeug für synaptodendritic Integrität 5-7 untersucht. In der Regel Zahlen von Phalloidin-positive (F-Actin) puncta reflektieren ein Gleichgewicht unter den aktiven Synapsen (erregenden und hemmenden), Aktindynamik und Synapse Stabilität 8.
Zwar ist es wichtig, spezifische t zu studierenypen von Synapsen (dh exzitatorischen Stacheln), wenn das Ziel der Behandlung ist es notwendig, nicht bekannt ist, zuerst die allgemeine Integrität einer Vielzahl von dendritischen Strukturen schätzen. Da F-Aktin ist eine Hauptkomponente von dendritischen Dornen und anderen Strukturen, einschließlich hemmende Synapsen, einer veränderten Anzahl von F-Aktin puncta eine Synaptopathie hinweisen. Diese Synaptopathie kann dann weiter für mehr spezifische Veränderungen untersucht werden. Unsere Quantifizierungsmethode mehrere synaptischen Arten / Strukturen zum Nachweis ergibt eine Gesamtschätzung von dendritischen synaptischen Veränderungen (Zunahmen und Abnahmen) nach verschiedenen experimentellen Behandlungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben Züchten wir Ratte kortikalen Neuronen bei geringer Dichte in 35 mm Glasboden-Gerichte, die uns Dendriten von einzelnen Neuronen zu identifizieren. Als nächstes benutzen wir Phalloidin und MAP2 Färbung zu dendritischen Änderungen erkennen. Dann haben wir spezialisierte Software-Änderungen in F-Actin puncta zu quantifizieren.
Um Änderungen in F-Aktin puncta bestimmen, muss das gesamte neuronale Netzwerk eines einzelnen Neurons deutlich sichtbar, ermöglich…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by NIH grants DA013137, DA031604, and HD043680. Partial support was provided by a NIH T32 training grant in Biomedical-Behavioral science.
Materials
| 35 mm Glass Bottom Dishes No. 1.5 coverglass | MatTek Corporation | P35G-1.5-20-C | |
| DMEM/F12 medium | Life Technologies | 10565-018 | |
| Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P9155 | |
| Boric acid | Sigma | B0252 | |
| Borax | Sigma | B9876 | |
| GlutaMax | Life Technologies | 35050-061 | 100X |
| Glucose | VWR | 101174Y | |
| HBSS | Sigma | H4641 | 10X |
| Neurobasal medium | Life Technologies | 21103-049 | |
| B-27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 50X |
| Antibiotic-Antimycotic solution | Cellgro | 30004CI | 100X |
| Sodium Bicarbonate | Life Technologies | 25080 | |
| Vannas Scissors | World Precision Instruments | 500086 | |
| Iris Scissors | World Precision Instruments | 500216 | |
| Iris Forceps | World Precision Instruments | 15914 | |
| Dumont #7 Forceps | World Precision Instruments | 14097 | |
| Dumont #5 Forceps | World Precision Instruments | 14095 | |
| ProLong Gold | Life Technologies | P36930 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Cover glass | VWR | 631-0137 | |
| AlexaFluor 488 Phalloidin | Life Technologies | A12379 | |
| Normal horse serum | Life Technologies | 26050-070 | |
| Chicken polyclonal anti-MAP2 | abcam | Ab92434 | |
| Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG | Life Technologies | A11042 | |
| NucBlue Live cell stain ReadyProbes Reagent Hoescht 33342 | Life Technologies | R37605 | |
| NIS-Elements software package | Nikon Instruments | ||
| Nikon Eclipse TE2000-E inverted fluorescent computer-controlled microscope | Nikon Instruments | ||
| 0.2 μm Nalgene nylon membrane filter | Fishersci | 151-4020 |
References
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