Summary

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em> Enterococcus spp.</em> Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

Published: March 09, 2016
doi:

Summary

Bu yazıda, aynı anda Enterococcus spp ölçmek için kullanılabilecek bir çift yönlü dijital PCR deneyi. Ve eğlence sularda genel olarak insan ilişkili dışkı kirlenme göstergeleri olarak HF183 genetik işaretleyiciler açıklanmaktadır.

Abstract

Bu yazının Enterococcus spp eşzamanlı ölçümü. Ve insan fekal-ilişkili HF183 işaretleyici için bir dubleks dijital PCR testi (EntHF183 dPCR) açıklar. EntHF183 dubleks dPCR (EntHF183 dPCR olarak anılacaktır buradan sonra) deneyi yayınlanmış bireysel kantitatif PCR (qPCR) meslektaşlarıyla aynı primer ve prob dizileri kullanır. Aynı şekilde, önce qPCR uygulandı aynı su filtreleme ve DNA ekstraksiyon prosedürleri dPCR çalıştırmadan önce takip edilmektedir. Ancak, dubleks dPCR tahlil qPCR deneyleri üzerinde birçok avantajı vardır. En önemlisi, dPCR tahlil hedefleri doğrudan ölçümü ile dolayısıyla standart bir eğri çalışan ve ihtiyacını, ilgili önyargı ve değişkenliği, ortadan kaldırır. QPCR (yani eşzamanlı kantifikasyon) enterokokların ve HF183 arkalı önlü ise ek olarak, çoğu kez bir numunede daha az bol hedefin ciddi küçümsenmesi yol açar, dPCR hem hedeflerin tutarlı ölçümü sağlar, uyandırmakona aynı reaksiyonda eş zamanlı olarak tek başına ya da miktarı. dPCR deneyi de qPCR tolere daha yüksek büyüklükte bir ya da iki emirler PCR inhibitörü konsantrasyonları tolere edebilmektedir. aynı anda iki ayrı qPCR deneyleri çalıştırmak için gerek kalmadan çevre sularda hem genel hem de insan-ilişkili fekal kontaminasyon doğru ve tekrarlanabilir bilgi sağlar, çünkü bu avantajlar EntHF183 dPCR tahlil özellikle çekici olun. qPCR üzerindeki avantajlara rağmen, şu anda mevcut cihaz olan dPCR deneyinde üst miktar sınırı yaklaşık qPCR elde edilebilenden daha düşük bir magnitüd dört işlemlerdir. Sonuç olarak, seyreltme, tipik pis su sızıntıları ardından gözlenen hedef organizmaların yüksek konsantrasyonlarının ölçümü için gereklidir.

Introduction

daha hızlı, daha esnek ve geleneksel kültür temelli yöntemlerle karşılaştırıldığında özel çünkü kantitatif PCR (qPCR) yöntemleri yaygın eğlence su kalitesi izleme ve mikrobiyal kaynak takibi uygulamalarında kullanılmaktadır. Sonuç olarak, qPCR gibi Enterococcus spp gibi genel fekal göstergeler için hızlı su izleme sonuçları elde etmek için tavsiye edilir. Revize USEPA eğlence su kalite kriterleri 1. Birçok qPCR deneyleri de geliştirilmiş ve çevresel sularda 2 fekal kontaminasyon kaynaklarının belirlenmesi için onaylanmıştır. Bunlar arasında, HF183 işaretleyici deneyleri en sık insan ilişkili fekal kontaminasyonu 3 tanımlamak için kullanılan arasındadır.

onlar ölçümü için standart eğriler güveniyor Ancak, qPCR sonuçlar genellikle önyargılı olabilir. qPCR bir stan kendi ölçümü döngüsünü (Cq) enterpolasyonlayarak örneklerinde hedefin bilinmeyen konsantrasyonlarını rakamlarlaCq ve seri seyreltilmiş standartların bir dizi logaritmik miktarı arasında doğrusal bir ilişki açıklanır dart eğrisi. güvenilir ve tutarlı standart referans malzeme eksikliği dolayısıyla büyük ölçüde qPCR sonuçlarını taraflı olabilir. Çalışmalar qPCR sonuçları farklı satıcılardan 4 yaklaşık yarım günlük kullanarak standartlarına göre farklılık ve aynı satıcıdan 5'ten standartların farklı toplu kullanarak 2 kat ile gösterdi.

Dijital PCR (dPCR) teknolojisi üniforma Nanoliter veya pikolitrelik reaksiyonlar 6 binlerce ya da milyonlarca içine toplu qPCR bölümleme tarafından oluşturulan minyatür PCR'ler çok sayıda pozitif sıklığını sayarak bilinmeyen bir örnek rakamlarla. Bölmeler-içinde-su yağ damlacıkları (örneğin, bu makale) ya da çip küçük fonksiyonlu odalar olması durumunda bu, sırası ile (yani, bu makale) damlacık dijital PCR veya odası, dijital PCR olarak ifade edilir. Daha yüksek bir Örnek konsantrasyonu hedef DNA'nın mevcudiyetinde sonuçlanırbölümleri daha yüksek bir oranda (dolayısıyla pozitif PCR), Poisson dağılımı ile yaklaştırılır bir ilişki. Bu nedenle, ikili sonuçlar (pozitif ya da negatif PCR) kaydedilir ve pozitif damlacıkların frekansı qPCR olarak standart bir eğri olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, doğrudan Poisson yaklaşım ile bilinmeyen numune konsantrasyonları hesaplamak için kullanılır.

Dijital PCR nicelikleme Bu ikili doğası qPCR 7 üzerinde ek avantajlar sağlamaktadır. gecikmiş amplifikasyon hala olumlu bir PCR sağlayabilir, çünkü dPCR miktar amplifikasyon verimliliği azaltır inhibisyonuna karşı daha sağlamdır. QPCR 8-10 göre dPCR yüksek hassasiyet yol qPCR olarak Benzer şekilde, dPCR miktar Cq değerleri değişkenlik etkilenmez.

Buna ek olarak, bölme işlemi etkin bir şekilde amplificatio sırasında (alt-tabaka rekabet en aza indirerek, her damla hedef DNA mevcut çok az miktarda sağlanırqPCR (yani bir tahlil aynı anda iki DNA hedefleri ölçen) duplekslemeyi ulaşmak için ortak engeller farklı DNA hedefleri) n. Bu nedenle, dubleks veya simpleks çalışma (yani bir hedef, tek bir deneyde ölçülen) olmadığını dPCR her iki hedeflerin 7,11 neredeyse ayırt edilemez miktarının üretir.

Bu makalede açıklanan dijital PCR deneyi (EntHF183 dPCR) amacı, genel dışkı göstergesi Enterococcus spp Eş zamanlı miktarının elde etmektir. Ve geliştirilmiş hassasiyet, tekrarlanabilirlik ve inhibisyonuna karşı sağlamlığı olan insan dışkı ilişkili HF183 markör olarak qPCR karşılaştırıldığında uzantılarıdır. Bu deney, başarılı bir şekilde, çevresel tatlı su, deniz suyu ve çeşitli dışkı maddesinin 7 dışkı kirlenme ölçülmesi için kullanılmıştır, ama aynı zamanda suları ve atık suların bir diğer türlerine de uygulanabilir. Bu tahlil, kendisine bağlı tortuları veya topraklar analiz etmek için büyük söz sahibidirinhibisyonuna yüksek tolerans s, ancak inhibitör örnekleri, bu tür karışımlar daha fazla test için karmaşıklığı gereklidir.

Protocol

1. Deney karışımı hazırlanması TE pH 8 tamponu tüm moleküler sınıf su içinde primer ve prob [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ 12 100 mol / L stok konsantrasyonları olun; HF183-1, BthetR1, BthetP1 3]. Not: iki hedef için sondalar floresan Malzemeleri / Ekipman Listesinde belirtildiği gibi farklı fluorophores 7 ile etiketlenir. Planlı reaksiyon başına, karıştırarak 12 ul dijital PCR karışımı master karışımı hazırlayın, 0.216 ul iler…

Representative Results

İyi bir EntHF183 dupleks dPCR çalıştırma kabul damlacıklar (yaklaşık 10,000-17,000) ve negatif ve pozitif damlacıklar 7 floresans değerleri arasında nispeten daha büyük bir fark (yaklaşık 5.000) nispeten yüksek sayıda neden olmalıdır. damlaların alışılmadık az sayıda büyük olasılıkla damlacık oluşturma sürecinde sorunları gösterir ve 10.000 damlacıkların bir kesim bu makalede kullanılan damlacık dPCR sisteminden ampirik v…

Discussion

protokolde birkaç kritik adımlar vardır. Ana Karışım, geleneksel qPCR ana karışımları daha viskoz olduğundan ilk deney karışımları karıştırılması zor olabilir. Basit vorteksleme da deney karışımları ve daha sonra damlacıklar DNA şablonları eşit olmayan dağılımına neden olur yeterli karıştırma, neden olabilir. protokol açıklanan karıştırma-by-pipetleme tekniği doğru dPCR ölçümünü sağlamak için takip edilmelidir. İkinci olarak, damlacıklar tek yapılı bir şekle ve boyut…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors have no acknowledgements.

Materials

Low Bind Microtubes Costar 3207 For storage of reagents, samples/production of master mixes
Nuclease Free Water FisherSci BP2484-50
TE pH 8 buffer FisherSci BP2473-100
Hardshell 96 Well Plate BioRad HSP-9601 For initial master mix and sample inoculation
Aluminum Sealing Film BioRad 359-0133 To seal sample plate
Droplet Generator BioRad 186-3002
Droplet Generation Oil BioRad 186-3005
Cartridge BioRad 186-4008
DG8 Cartridge Holder BioRad 186-3051
Gasket BioRad 186-3009
20uL pipet tips Rainin GP-L10F For tansferring sample/master mix to cartidge
200uL pipet tips Rainin GP-L200F For transferring droplets to final Twin.Tec Plate
Twin.Tec 96 Well Plate Eppendorf 951020320 For final droplets thermal cycling and reading
Pierceable Heat Seal Foil BioRad 181-4040 To seal Twin.Tec plate before thermalcycling
PX1 PCR Plate Sealer BioRad 181-4000 Only the thermal cycler is needed, no optics
CFX96 Thermalcycler BioRad CFX96 and C1000
QX100 Droplet Reader BioRad 186-3001
Droplet Reader Oil BioRad 186-3004
Droplet PCR Supermix  BioRad 186-3024 i.e. the digital PCR mix in manuscript
QuantaSoft software (v1.3.2) Quantasoft  QX100  For viewing, analyzing, and exporting ddPCR data
Entero Forward Primer (Ent F1A) Operon GAGAAATTCCAAACGAACTTG Alternative vendor can be used
Entero Reverse Primer (Ent R1) Operon CAGTGCTCTACCTCCATCATT Alternative vendor can be used
Entero Probe (GPL813TQ) Operon [6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1] Alternative vendor can be used, but the florophore has to be FAM
HF183 Forward Primer (HF183-1) Operon ATCATGAGTTCACATGTCCG Alternative vendor can be used
HF183 Reverse Primer (BthetR1) Operon CGTAGGAGTTTGGACCGTGT Alternative vendor can be used
HF183 Probe (BthetP1) Operon [6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC
ACATTGGA-[BHQ1]
Alternative vendor can be used, but the florophore has to be HEX (if using VIC, then the appropriate matric compensation must be chosen. 
Positive control Mixture of E.faecalius genomic DNA and HF183 standard plasmid (ordered from IDT). For detailed methods in culturing E. faecalius and sequences of the ordered HF183 plasmid, please see Cao et al 2015 (doi:10.1016/j.watres.2014.12.008). Commercilaly available Enterococcus DNA standards (ATCC 29212Q-FZ) can also be used in the positive control in place of lab-prepared E. faecalis genomic DNA.

References

  1. Boehm, A. B., et al. Performance of forty-one microbial source tracking methods: A twenty-seven lab evaluation study. Water Res. 47 (18), 6812-6828 (2013).
  2. Layton, B. A., et al. Performance of human fecal anaerobe-associated PCR-based assays in a multi-laboratory method evaluation study. Water Res. 47 (18), 6897-6908 (2013).
  3. Cao, Y., et al. Effect of platform, reference material, and quantification model on enumeration of Enterococcus by quantitative PCR methods. Water Res. 47 (1), 233-241 (2013).
  4. Sivaganesan, M., Siefring, S., Varma, M., Haugland, R. A. MPN estimation of qPCR target sequence recoveries from whole cell calibrator samples. J. Microbiol. Methods. 87 (3), 343-349 (2011).
  5. Huggett, J. F., et al. The Digital MIQE Guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clin. Chem. 59 (6), 892-902 (2013).
  6. Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. Droplet digital PCR for simultaneous quantification of general and human-associated fecal indicators for water quality assessment. Water Res. 70, 337-349 (2015).
  7. Sanders, R., Huggett, J. F., Bushell, C. A., Cowen, S., Scott, D. J., Foy, C. A. Evaluation of Digital PCR for Absolute DNA Quantification. Anal. Chem. 83 (17), 6474-6484 (2011).
  8. Whale, A. S., et al. Comparison of microfluidic digital PCR and conventional quantitative PCR for measuring copy number variation. Nucleic Acid Res. 40 (11), 82-89 (2012).
  9. Hindson, C. M., et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).
  10. Morisset, D., Štebih, D., Milavec, M., Gruden, K., Žel, J. Quantitative analysis of food and feed aamples with droplet digital PCR. PLoS One. 8 (5), e62583 (2013).
  11. Cao, Y., et al. Evaluation of molecular community analysis methods for discerning fecal sources and human waste. Water Res. 47 (18), 6862-6872 (2013).

Play Video

Cite This Article
Cao, Y., Raith, M. R., Griffith, J. F. A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters. J. Vis. Exp. (109), e53611, doi:10.3791/53611 (2016).

View Video